Articles

rolul evolutiv al produselor naturale din pădurile tropicale tropicale ca sursă Reaprovizionabilă de noi medicamente conduce

publicitate

Abordări moderne în descoperirea medicamentelor din produse naturale

sosirea tehnologiilor noi în spectrometria de masă, RMN și alte tehnici spectroscopice, screening-ul bimolecular sau pe bază de celule, caracterizarea timpurie a loviturilor și utilizarea metodelor de calcul au îmbunătățit impactul produselor naturale în medicamentele pe bază de HTS descoperire. Extractele de produse naturale conțin frecvent un număr mare de constituenți cuprinzând cele care sunt dificil de separat. Structurile lipsite de ambiguitate ale compușilor Puri pot fi determinate prin combinarea tehnicilor convenționale, cum ar fi spectroscopia de absorbție ultravioletă (UV), IR, MS și RMN. În cazuri rare, în care există o dificultate în determinarea configurației absolute, se folosește analiza cu raze X cu un singur cristal. Tehnicile convenționale de separare sunt consumatoare de timp și obositoare. Cratimarea directă a unei tehnici de separare competente cu tehnici spectroscopice eficiente, cum ar fi HPLC-FTIR, poate fi utilizată pentru a sprijini procesul de dereplicare . HPLC-FTIR a fost utilizat pentru detectarea grupărilor funcționale în constituenții principali ai amestecurilor, dar nu a găsit o aplicare extinsă din cauza limitărilor de compatibilitate; adică obținerea unei separări optime însoțită de o detectare adecvată .

una dintre noile tehnologii în descoperirea medicamentelor din produse naturale este utilizarea electroforezei capilare (CE) în programul de screening dezvoltat pentru prima dată de Cetek Corporation și Cubist. Testul este capabil să identifice compușii/ extractele active ale produsului natural și prin detectarea oricărei schimbări a proteinei atunci când un ligand se leagă de acesta datorită modificărilor de încărcare conformațională și de suprafață. Tehnica CE poate distinge între compușii de legare slabi și puternici din extracte înainte de determinarea concentrației lor . Această tehnologie a fost aplicată programului intern de descoperire a medicamentelor Cetek în găsirea unor compuși naturali noi care inhibă ținta cancerului, HSP90, un chaperonin molecular care este responsabil pentru menținerea plierii și stabilității corecte a proteinelor . Un alt exemplu interesant care a fost raportat recent de Wang și colab.a arătat că o metodă CE în combinație cu cromatografia lichidă-spectrometrie de masă tandem (LC-MS/MS) a fost aplicată cu succes în screeningul extractelor de plante, a identificat cu succes un compus natural numit baicalin din Radix Scutellaria ca un nou inhibitor al protein kinazei an . Într-un alt studiu separat, Zhao și Chen, au dezvoltat un microreactor capilar imobilizat cu neuraminidază simplu și eficient, facbricat de tehnologia de reticulare a glutaraldehidei pentru screeningul inhibitorilor de neuraminidază din medicamentele tradiționale chinezești. Șase din optsprezece produse naturale, inclusiv bavachinin, bavachin, baicalein, baicalin, chrysin, și vitexin au fost găsite ca inhibitori puternici de screening. Unele aspecte importante ale CE care merită o recunoaștere în acest capitol sunt ușurința de utilizare, versatilitatea și componentele de separare de înaltă rezoluție, eficiența ridicată a separării și cantitatea redusă de consum de probă și reactiv.

analiza fluxului de injecție-RMN (FIA-RMN) cuprinde o probă, care este injectată ca un dop într-un flux de fluid și apoi măturată în bobina detectorului RMN. Într-un FIA-RMN, faza mobilă este utilizată ca solvent hidraulic de împingere care transferă proba injectată din portul injectorului în celula de flux RMN. Scanarea scout care este utilizată pentru a determina locația vârfurilor solventului este obținută de spectrometru odată ce pompa se oprește. În cele din urmă, un semnal este trimis la pompa de solvent, astfel încât proba veche din celula de flux RMN să poată fi spălată . HPLC-RMN-MS este o metodă spectrometrică nouă și cea mai avansată care este utilizată în de-replicarea extractelor naturale de produse . În ciuda faptului că este cea mai eficientă metodă, beneficiul metodologiei cratimate menționate mai sus este potrivirea datelor MS cu spectrul RMN. În plus, informațiile grupurilor funcționale (de ex., hidroxil și amino fragmente) care sunt livrate de HPLC-RMN este ușor identificat prin tehnicile SM. Apariția magneților de câmp superior și a sondelor crio s-a dovedit a fi un instrument spectroscopic puternic și eficient și aplicat extractelor brute (RMN și profil UV din detectarea PDA HPLC). Există o îmbunătățire semnificativă a sensibilității la profilare și a de-replicării produselor naturale datorită utilizării magneților de câmp mai mari și a dezvoltărilor recente ale micro-bobinei HPLC-RMN și RMN capilar (CapNMR), care a permis examinarea unor cantități mai mici de probe în ordinea 40-120 unktil . Micro-bobina HPLC-RMN este cea mai potrivită pentru HPLC-RMN online, care utilizează experimentele on flow , stop flow sau Time silencing pentru a separa componentele prezente în concentrații mai mari și analizează la fel, în timp ce RMN capilar folosește solvenții non-deuterați într-o separare HPLC off-line, oferind astfel o gamă largă de solvenți cu un cost redus. Compușii izolați sunt re-dizolvați în solvenți deuterați și apoi injectați în sonda de curgere CapNMR folosind volume de aproximativ 6 ilqql cu spectre 1H-RMN dobândite pentru cantități de probă în ordinea 2-30 ilqqg, crescând astfel sensibilitatea cu perspectiva clasificării noilor metaboliți secundari de nivel scăzut .

pe lângă cele de mai sus, informațiile obținute din spectrele RMN 1D și 2D sunt suficiente pentru a clasifica compușii în plus față de furnizarea unui instantaneu de înaltă fidelitate a constituenților din extract, oferind astfel informațiile care deschid calea pentru decizii raționale cu privire la metoda de fracționare de vârf sau pentru a continua izolarea. Multe publicații recente au fost raportate folosind această abordare .Tehnica și utilizarea HPLC-RMN în identificarea / clasificarea produselor naturale este bine recunoscută în literatura de specialitate, dar aplicațiile utilizărilor sale s-au ocupat în principal doar de profilarea chimică a plantelor . Numeroase moduri de HPLC-RMN (mai ales modurile on-flow și stop-flow) combină puterea de rezolvare a cromatografiei, care este interfațată cu înțelegerea structurală oferită de RMN. Abordarea reducționistă nu a avut mare succes în descoperirea unor medicamente eficiente pentru tratarea bolilor complexe, cum ar fi cancerul, bolile metabolice, cardiovasculare și neurologice. Medicamentele cu o singură țintă nu pot induce întotdeauna efectul dorit asupra întregului sistem biologic, chiar dacă inhibă sau activează cu succes o anumită țintă.Există limitări în utilizarea abordării reducționiste sau mono-țintă în descoperirea drogurilor. Abordarea oferă doar o înțelegere limitată a patogenezei complicate și a patologiilor multi-țintă ale bolilor sistemice, cum ar fi cancerele, bolile cardiovasculare și tulburările neurodegenerative. Există dificultăți în identificarea intervențiilor relevante pentru a viza astfel de complexități. Intervenția medicamentoasă pe bază de glonț sau mono-țintă nu poate combate în mod eficient patologiile complexe ale bolilor sistemice, deoarece acestea sunt reglementate de rețele biologice complexe și depind de mai multe etape ale provocărilor genetice și de mediu pentru a progresa. Recent, există un interes din ce în ce mai mare de a utiliza abordări inovatoare pentru descoperirea medicamentelor din produse naturale prin farmacologie de rețea care integrează biologia sistemelor și farmacologia . Conceptul multidisciplinar integrat de ținte multiple, efecte multiple și boli complexe în farmacologia rețelei ne-a îmbogățit înțelegerea patogenezei complicate și a patologiilor multi-țintă ale bolilor sistemice și a redus dificultatea de a identifica intervențiile relevante pentru a viza astfel de complexități. Tehnologiile ‘- omic ‘ din biologia sistemelor au fost acum utilizate pe scară largă pentru a corela și elucida mai multe ținte și rețele de boli umane și acțiuni de droguri . Conceptul de farmacologie de rețea este util în special în traducerea și interpretarea corectă a efectelor terapeutice ale medicamentelor pe bază de plante în semnificații biochimice și biologice moderne. Medicamentele pe bază de plante pot servi ca resurse valoroase pentru descoperirea medicamentelor multi-țintă bazate pe rețea. Conceptul de farmacologie de rețea este util în special în traducerea și interpretarea corectă a efectelor terapeutice ale medicamentelor pe bază de plante în semnificații biochimice și biologice moderne. Eficacitatea medicamentelor multi-țintă din extracte din plante sunt dezvoltate, urmate de identificarea componentelor lor bioactive majore și reamenajarea unei formulări multi-componente complet noi compuse din componentele bioactive majore pentru a ajunge la o combinație sinergică și optimă .

combinarea chimiei naturale a produselor și a abordărilor metabolomice în descoperirea medicamentelor este o nouă strategie pentru a descoperi noi medicamente. Există puține rapoarte în literatura științifică, care discută unison dintre abordările clasice ale chimiei produselor naturale cu metabolomica pentru a identifica noi produse naturale bioactive. Acestea s-au concentrat în general pe studiul plantelor . Identificarea produselor naturale bioactive din plante rămâne o sarcină multilaterală datorită diversității și complexității lor chimice ridicate. Prin măsurarea metabolomului diferitelor extracte sau fracțiuni ale unei plante și combinarea acestor date cu activitatea biologică corespunzătoare, semnalele legate de compușii legați de activitatea afișată pot fi potențial determinate. Biologia sistemelor este un domeniu cel mai promițător care cuprinde instrumente în Revoluția post-genomică, cum ar fi omicele de transcriere, proteomica, glicomica și fluxomica, cu intenția de a caracteriza toate produsele genetice și celulare complet incluzând ARNm, proteine, structuri glicane și metaboliți. Metabolomica își propune să construiască observații echilibrate folosind instrumente foarte reproductibile urmate de analiza datelor pentru a localiza corelațiile dintre datele disponibile. Profilarea tuturor metaboliților cu greutate moleculară mică ai unui organism nu este posibilă și, prin urmare, acest domeniu emergent al metabolomicii combină chimia analitică, biochimia și biologia computațională care permite analiza a mii de metaboliți în orice sistem biologic. Principalele platforme analitice sunt spectrometria de masă cu cromatografie în gaz (MS-GC), cromatografie lichidă (LC) sau electroforeză capilară (CE) și spectroscopie RMN. O procedură de extracție echilibrată pentru a extrage eficient toți metaboliții primari și secundari din țesuturi și fluidele corporale este utilizată pentru a le obține în formă naturală înainte de analiză în diferiții solvenți utilizați. Procedurile de extracție a metaboliților sunt mai complicate și mai complexe datorită naturii diversificate a moleculelor mici prezente și datorită indisponibilității unei singure tehnici și platforme analitice care ajută la analiza simultană a tuturor metaboliților. Trebuie aplicate mai multe tehnici și metodologii de separare pentru a realiza o analiză completă a metaboliților . Analiza simultană a sute de compuși se realizează prin diverse instrumente în informatică care extrage informații din date, eliminând zgomotul de fond, detectarea și integrarea vârfurilor în seturi mari de date și normalizarea și transformarea matricelor de date rezultate înainte de orice analiză statistică . Metabolomica are un acces limitat la capacitatea de identificare a semnalelor în ceea ce privește natura chimică. Aproximativ 60 până la 80% din toți compușii detectați sunt necunoscuți chiar și astăzi, iar disciplina metabolică a creat o masă mare de bibliotecă spectrală RMN pentru a aborda această problemă. Aceste structuri necunoscute ale metaboliților secundari pot fi una dintre resursele nedescoperite ale produselor naturale, amprentarea, imprimarea piciorului, profilarea sau analizele țintă sunt termeni obișnuiți utilizați în acest domeniu. Amprentarea are scopul de a realiza un instantaneu al organismului în care semnalele nu pot fi utilizate în mod necesar pentru detectarea/identificarea metaboliților specifici și depind în mare măsură de tehnica utilizată. Semnalele sunt atribuite unui metabolit, indiferent de natura sa, pentru a fi un compus cunoscut sau un compus nou. Termenul de analiză țintă își propune să determine și să cuantifice un metabolit specific de interes .

microarray este o nouă tehnologie recent dezvoltată care a împuternicit comunitatea științifică să înțeleagă aspectele fundamentale care subliniază creșterea și dezvoltarea vieții, precum și să exploreze cauzele genetice ale anomaliilor care apar în funcționarea corpului uman.Tehnologia microarray ADN poate analiza și compara modificările ADN-ului sau proteinelor. O schimbare cromozomială la un individ anormal ar putea fi identificată atunci când ADN-ul de la acest individ este comparat cu ADN-ul (controlul) de la un individ sănătos. Este foarte precis și util prin faptul că este capabil să detecteze modificări mult mai mici în comparație cu tehnica convențională de cariotipare. Această tehnică competentă ne-a permis să înțelegem aspectele elementare care subliniază creșterea și dezvoltarea vieții, precum și să explorăm cauzele genetice ale anomaliilor care apar în funcționarea corpului uman. Tehnologia Microarray a fost utilizată pe scară largă în farmacogenomică, unde analiza comparativă a genelor dintr-o celulă nesănătoasă și o celulă normală va ajuta la identificarea Constituției biochimice a proteinelor sintetizate de genele anormale/nesănătoase. Informațiile obținute din analiză ar putea fi apoi utilizate pentru sinteza și proiectarea medicamentelor care luptă împotriva proteinelor anormale și reduc efectul acestora .Kwon și colegii săi au dezvoltat o abordare in vitroaproach utilizând un sistem de microarray care conține mai multe enzime pentru sinteza de mare viteză a produsului derivat din polipeptide și screeningul complet al bibliotecii pe bază de poliketide a tirozin kinazei umane (TK), pe un singur microarray de sticlă. Se așteaptă ca inhibitorii TK să trateze leucemia mieloidă cronică, tumorile stromale gastrointestinale și cancerul de sân .

un program de descoperire de droguri își propune să găsească noi produse naturale bioactive, care posedă o formă de activitate biologică puternică. Cu toate acestea, izolarea produselor naturale cunoscute și nedorite, fără interes farmacologic sau chimic, este inevitabilă. Termenul de dereplicare, care este un proces de identificare a compușilor cunoscuți responsabili de activitatea unui extract înainte de izolarea ghidată de Biotest, devine popular printre cercetătorii produselor naturale . Strategiile de dereplicare implică, în general, o combinație de bioteste, știință de separare, metode spectroscopice și căutarea bazelor de date și pot fi considerate procese de screening chimice sau biologice. Există o serie de moduri în care programele de produse naturale abordează dereplicarea, care se bazează pe disponibilitatea metodelor/instrumentelor de screening, timpul și costul pentru identificarea posibilelor ‘piste biologice sau compuși noi’ dintr-un extract brut. În prezent, există multe metodologii și protocoale avansate care disting entitățile noi de compușii naturali cunoscuți într-un stadiu incipient al unui program de descoperire a medicamentelor sau într-o strategie de izolare a produselor naturale . Procesul de dereplicare poate fi realizat cu ușurință prin screening-ul compușilor prin bazele de date disponibile în comerț, reducând timpul necesar pentru elucidarea structurii compușilor cunoscuți. Un exemplu este dicționarul Chapman și Hall al produselor naturale ; dicționarul produselor naturale Marine (on-line) (subset al dicționarului produselor naturale) care conține peste 30.000 de compuși; MarinLit – baza de date a produselor naturale Marine care conține date bibliografice actualizate despre organismele marine cu numărul de referințe din 1.200 de reviste/cărți și date pentru ~21.000 de compuși ; AntiMarin este o bază de date mai recentă, în care numărul de grupări metil, numărul de metilen hibridizat sp3 sau protoni metinici, alchenă, acetal, eter și formil grupări pot fi căutate . În plus, SciFinder Scholar și SCOPUS sunt instrumente importante de descoperire a cercetării (rezumate chimice on-line), iar NAPRALERTTM este o bază de date a tuturor produselor naturale, inclusiv informații etnomedicale, informații farmacologice/biochimice ale extractelor de organisme in vitro, in situ, in vivo, la om (rapoarte de caz, studii non-clinice) și studii clinice . Disponibilitatea acestor baze de date științifice, cum ar fi cele menționate instituțiilor de cercetare și academice, este un pas fundamental și crucial într-un program de produse naturale bine guvernat. Odată cu creșterea numărului de ținte noi de droguri, au fost aplicate metode de calcul, cum ar fi screening-ul virtual de mare viteză, instrumentele de andocare a ligandului, profilarea ADME (absorbție, distribuție, metabolism și excreție) și alte instrumente și programe de calcul moderne pentru a accelera procesul de descoperire a medicamentelor. Unele dintre bibliotecile și bazele de date comune ale produselor naturale, așa cum sunt enumerate mai jos, permit screeningul prompt al unui număr mare de compuși naturali să se facă într-o perioadă scurtă de timp împotriva unei varietăți de ținte de droguri. Dicționar de produse naturale (http://dnp.chemnetbase.com/intro/index.jsp); UCSD Marine natural Products Database (http://naturalprod.ucsd.edu/); produse naturale Alert (http://napralert.org/) ;ZINC (http://zinc.docking.org/browse/catalogs/natural-products) ; InterBioScreen (http://www.ibscreen.com/products.shtml); Analiticon Discovery (http://www.ac-discovery.com/);Molecular Diversity Preservation International (http://www.mdpi.org/). Modele generate de Computer de proteine, inclusiv noi ținte enzimatice și receptoare, în afară de structurile cristaline proteice care sunt depozitate în Banca de date a proteinelor (http://www.pdb.org/) pot fi generate cu ușurință prin modelarea omologiei urmată ulterior de andocarea moleculară simplă pentru a examina interacțiunile dintre compușii naturali și țintele proteice. Biotesturile pot fi apoi efectuate selectiv pe loviturile naturale sau pe conductele recuperate fără necesitatea de a pierde cantitatea prețioasă de compuși și de a evita metodele experimentale costisitoare și consumatoare de timp. Exemple de software de andocare moleculară disponibile în prezent sunt AutoDock, AutoDockVina, FlexX, FRED, GOLD, eHiTS și lead finders. Câteva exemple care utilizează screening-ul virtual de mare viteză, inclusiv activitatea lui Wang și colab. în cazul în care zece compuși naturali au fost identificați cu succes ca inhibitori ai flacipain-2 (FP-2) și Liu și colab. OMS au identificat un inhibitor de dimerizare STAT3 asemănător unui produs natural prin screening virtual bazat pe structură .

alte instrumente bioinformatice, cum ar fi ligandul și screeningul farmacofor bazat pe structură, au fost, de asemenea, raportate ca având succes în asistarea procesului de descoperire a medicamentelor din produse naturale. Chen și colab. au propus un model cantitativ de farmacofor structură-activitate tridimensional bazat pe inhibitori cunoscuți ai mTOR. Screening-ul Virtual folosind cel mai bun model de farmacofor recuperat cu succes 20 de produse naturale ca potențiali inhibitori mTOR schele. De asemenea, este important să menționăm aici că din studiul anterior realizat de Doman a arătat că din 365 de molecule sugerate prin andocare, 127 (34, 8%) dintre ele au inhibat activitatea proteinei enzimatice tirozin fosfatază-1b (PTP1B), în timp ce doar 85 (0, 021%) din aproximativ 400.000 de molecule au fost preluate din testul experimental cu randament ridicat. Aceasta este o îmbogățire de aproximativ 1700 de ori a ratei de succes de la andocarea bazată pe structură peste screening aleatoriu .Pe de altă parte, încorporarea instrumentelor chimioinformatice în descoperirea medicamentelor din produse naturale permite compușilor să fie examinați pentru proprietățile lor ADMET (absorbție, distribuție, metabolism, excreție și toxicitate) înainte de a fi înscriși în orice programe de dezvoltare a medicamentelor. Screeningul compușilor naturali folosind regula Pfizer 5 permite cercetătorilor să elimine orice molecule care nu respectă regulile. Deoarece aceste reguli au fost derivate dintr-un set de observații experimentale a mii de medicamente cunoscute și molecule asemănătoare medicamentelor, un chimist/biochimist medicinal instruit poate folosi cu ușurință in silicodata ca ghid în determinarea potențialilor compuși naturali asemănători medicamentelor, urmată de sinteza analogilor suplimentari, astfel încât să aibă proprietăți favorabile asemănătoare medicamentelor. O moleculă bună asemănătoare unui medicament respectă în general următoarele reguli (i) greutate moleculară 500, (ii) logp calculat 5, (iii) numărul donatorilor de legături de hidrogen 5 și (iv) numărul acceptorilor de legături de hidrogen 10. Introducerea în silicoscreening și facilități de produse naturale pentru screening-ul de mare capacitate în laboratoarele academice, precum și în companiile de medicamente reduce costul de screening aleatoriu al colecțiilor foarte mari de compuși. În silicoor screening-ul virtual ajută la filtrarea numărului de compuși utilizați în ecrane reale . Pe de altă parte, instrumentul bioinformatic, cum ar fi dicționarul produselor naturale, oferă informații structurale despre 150.000 de compuși diferiți care ar putea fi utilizați în screeningul virtual, chiar dacă compușii ar trebui să fie disponibili fizic pentru ca orice activitate prezisă să fie confirmată prin testare într-un test relevant. În cele din urmă, gruparea schelelor legate chimic poate fi foarte utilă în ghidarea sintezei de compuși noi, dar, evident, există o întârziere și cheltuieli în sinteză.

o colaborare academică a stabilit portalul de descoperire a medicamentelor (vezi http:// www.ddp.strath.ac.uk/) în încercarea de a combina tehnicile de screening virtual al produselor naturale diverse din punct de vedere chimic și analogii lor sintetici cu disponibilitatea rapidă a probelor fizice pentru testare, Acest lucru permite o mare varietate de compuși din laboratoarele academice din multe instituții diferite într-o bază de date care poate fi utilizată pentru screening virtual. Grupurile de biologie academică propun, de asemenea, structuri proteice noi și noi ca ținte pentru screeningul virtual cu baza de date a portalului (și cu baze de date convenționale disponibile în comerț). Când loviturile sunt prezise de la in silicoscreening, compușii pot fi obținuți de la chimistul originar pentru teste de confirmare. Adesea, există o legătură imediată cu expertiza pentru pregătirea analogilor pentru a ajuta la începerea unui program de optimizare a plumbului. Cu toate acestea, accesul la Portal este disponibil gratuit pentru grupul academic. Extinderea continuă a bazei de date chimice înseamnă că există o acoperire valoroasă și în creștere a spațiului chimic al multor compuși chimici noi. Deși compușii din Baza de date a portalului vor fi, în general, deja dezvăluiți într-o teză sau într-un jurnal de chimie, foarte puțini dintre ei au fost testați anterior pentru activitate biologică. Aceasta este o caracteristică comună a produselor naturale cunoscute: din cele 150.000 de structuri din dicționarul CRC al produselor naturale, doar 1% dintre ele au fost investigate. Introducerea tehnologiilor metabolomice în procesele naturale de descoperire a produselor va fi benefică pe mai multe niveluri. Prin creșterea numărului de identificări în datele noastre metabolomice, compușii cu structuri noi pot fi ușor obținuți și testați pentru orice boală investigată. Mai mult, analiza multi-paralelă folosind tehnologii metabolomice va spori, de asemenea, debitul proceselor de Caracterizare chimică a multor specii diferite din resursele naturale. Deoarece chimiștii de produse naturale au colectat o durată de viață a bibliotecilor compuse de compuși puri activi și, de asemenea, inactivi, aceste date pot fi utilizate pentru a construi bibliotecile spectrale de masă și RMN, fără îndoială, ajută interpretările biologice ale datelor metabolomice să fie făcute cu mai puțină dificultate. Progresele în instrumentarea analitică și despărțirea sofisticată a tehnicilor de separare cu detectoare sensibile ridicate au permis o mai mare detectare a compușilor cu molecule mici măsurabile în sistemele biologice (adică metaboliți primari și secundari). Aceste tehnologii pot fi folosite pentru a avansa descoperirea chimiei naturale a produselor pentru a identifica potențiali candidați noi la medicamente care vor ajuta la susținerea sănătății și la lupta împotriva bolilor și bolilor. În cazul RMN al extractelor brute, modelele pot fi ușor vizualizate și interpretate folosind analiza datelor multivariate. Acest lucru poate fi realizat într-o manieră comparativă care distinge diferențele dintre extractele relativ similare sau poate fi legat de o activitate biologică specifică (în general in vitro). În cele din urmă, acest lucru permite construirea unei baze de date complexe a metabolomului .

Lasă un răspuns

Adresa ta de email nu va fi publicată.