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A Evolução do Papel dos Produtos Naturais da floresta Tropical como uma Fonte Renovável de Nova Droga Leva

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Modernas abordagens de descoberta de medicamentos a partir de produtos naturais

A chegada de novas tecnologias em espectrometria de massas, RMN e outras técnicas espectroscópicas, bimolecular de destino ou célula de triagem, cedo bateu a caracterização e a utilização de métodos computacionais têm melhorado o impacto de produtos naturais em HTS com base descoberta de drogas. Extratos de produtos naturais freqüentemente contêm um grande número de constituintes compreendendo aqueles, que são difíceis de separar. As estruturas inequívocas de compostos puros podem ser determinadas pela combinação de técnicas convencionais como espectroscopia de absorção ultravioleta (UV), IR, MS e NMR. Em casos raros, onde há uma dificuldade em determinar a configuração absoluta, a análise de raios X de cristal único é empregada. As técnicas de separação convencionais são demoradas e cansativas. A hifenização direta de uma técnica de separação proficiente com técnicas espectroscópicas eficientes, como HPLC-FTIR, pode ser usada para suportar o processo de deseplicação . HPLC-FTIR tem sido usado para detectar grupos funcionais nos principais constituintes de misturas, mas não encontrou aplicação extensiva devido a limitações na compatibilidade; ou seja, obter separação ideal acompanhada de detecção adequada .

Uma das novas tecnologias na descoberta de medicamentos a partir de produtos naturais é o uso de eletroforese capilar (CE) no programa de triagem primeiro desenvolvido pela Cetek Corporation e Cubista. O ensaio é capaz de identificar compostos / extratos ativos de produtos naturais e detectando qualquer mudança na proteína quando um ligante se liga a ele devido às mudanças de carga conformacional e superficial. A técnica CE pode distinguir entre compostos de ligação fracos e fortes em extratos antes de determinar sua concentração . Esta tecnologia foi aplicada ao programa interno da descoberta da droga de Cetek em encontrar compostos naturais novos do produto que inibem o alvo do cancro, HSP90, uma chaperonin molecular que seja responsável para manter a dobradura e a estabilidade corretas das proteínas . Outro exemplo interessante que foi recentemente relatado por Wang, et al.mostrou que um método de CE em conjunto com cromatografia líquida-espectrometria de massa em tandem (LC-MS/MS) foi aplicado com sucesso na triagem de extratos vegetais, identificou com sucesso um composto natural chamado Baicalina de Radix scutellariaeas uma nova proteína quinase um inibidor . Em outro estudo separado, Zhao e Chen, desenvolveram um microrreator capilar imobilizado com neuraminidase simples e eficaz, fabricado pela tecnologia de reticulação de glutaraldeído para triagem dos inibidores da neuraminidase de medicamentos tradicionais Chineses. Seis dos dezoito produtos naturais, incluindo bavachinin, bavachin, baicalein, baicalin, chrysin, e vitexin foram encontrados como potentes inibidores da triagem. Alguns aspectos importantes da CE que merecem um reconhecimento neste capítulo são sua facilidade de uso, versatilidade e componentes de separação de alta resolução, alta eficiência de separação e sua baixa quantidade de consumo de amostra e reagente.

Análise de Injeção De Fluxo-NMR (FIA-NMR) engloba uma amostra, que é injetada como um tampão em uma corrente de fluido e depois varrida para a bobina do detector de NMR. Em um FIA-NMR, a fase móvel é usada como um solvente hidráulico do impulso que transfira a amostra injetada do porto do injetor à pilha de fluxo do NMR. O scout scan que é usado para determinar a localização dos picos de solvente é obtido pelo espectrômetro assim que a bomba parar. Finalmente, um sinal é enviado para a bomba de solvente para que a amostra antiga da célula de fluxo NMR possa ser liberada . HPLC-NMR-MS é um novo e mais avançado método espectrométrico que é usado na replicação de extratos de produtos naturais . Apesar de ser o método mais eficaz, o benefício da referida metodologia hifenizada acima é a correspondência dos dados MS com o espectro de RMN. Além disso, as informações dos grupos funcionais (por exemplo,, hidroxila e amino porções) que são entregues pela HPLC-NMR é prontamente identificado por técnicas de MS. O advento de ímãs de campo mais altos e sondas cryo provou que a HPLC-NMR era um instrumento espectroscópico forte e eficaz e aplicado aos extratos brutos (RMN e perfil UV da detecção de PDA HPLC). Há uma melhoria significativa na sensibilidade de perfilamento e na des-replicação de produtos naturais devido à utilização de ímãs de campo mais altos e aos desenvolvimentos recentes da micro bobina HPLC-NMR e NMR capilar (CapNMR) que permitiu que quantidades menores de amostras fossem examinadas na ordem de 40-120 µL . A micro bobina HPLC-NMR é mais adequada para HPLC-NMR on-line que usa o fluxo ligado, fluxo de parada ou experimentos de silenciamento de tempo para separar componentes presentes em maiores concentrações e analisa o mesmo , enquanto a RMN capilar usa os solventes não deuterados em uma separação off-line de HPLC, oferecendo assim uma ampla gama de solventes com baixo custo. Os compostos isolados são re-dissolvidos em solventes deuterados e então injetados na sonda de fluxo CapNMR usando volumes de cerca de 6 µL com espectros de 1h-NMR adquiridos para quantidades de amostra na ordem de 2-30 µg, aumentando assim a sensibilidade com uma perspectiva de classificar os novos metabólitos secundários de baixo nível .

Além disso, as informações obtidas a partir de 1D e 2D RMN os espectros é suficiente para classificar os compostos além do fornecimento de um ‘alta fidelidade’ instantâneo dos constituintes do extrato, assim, fornecer a informação, que abre caminho para decisões racionais sobre o topo método de fracionamento ou para continuar com o isolamento de mais. Muitas publicações recentes foram relatadas usando essa abordagem .A técnica e utilização de HPLC-RMN na identificação/classificação de produtos naturais é bem reconhecida na literatura, mas as aplicações de seus usos trataram principalmente apenas do perfil químico das plantas . Numerosos modos de HPLC-NMR (principalmente modos on-flow e stop-flow) combinam o poder de resolução da cromatografia, que está em interface com o entendimento estrutural fornecido pela NMR. A abordagem reducionista não teve muito sucesso em descobrir medicamentos eficazes para tratar doenças complexas, como câncer, doenças metabólicas, cardiovasculares e neurológicas. Os medicamentos de alvo único nem sempre podem induzir o efeito desejado em todo o sistema biológico, mesmo que inibam ou ativem com sucesso um alvo específico.Existem limitações no uso de abordagem reducionista ou mono-alvo na descoberta de drogas. A abordagem produz apenas uma compreensão limitada da patogênese complicada e patologias multi-alvo de doenças sistêmicas, como câncer, doenças cardiovasculares e distúrbios neurodegenerativos. Há dificuldade em identificar intervenções relevantes para atingir tais complexidades. A intervenção medicamentosa baseada em balas ou mono-alvo não pode efetivamente combater as patologias complexas de doenças sistêmicas, pois são reguladas por redes biológicas complexas e dependem de várias etapas dos desafios genéticos e ambientais para o progresso. Recentemente, há um interesse crescente em usar abordagens inovadoras para a descoberta de medicamentos a partir de produtos naturais por farmacologia de rede que integra biologia de sistemas e farmacologia . O conceito multidisciplinar integrado de múltiplos alvos, múltiplos efeitos e doenças complexas na farmacologia de rede enriqueceu nossa compreensão da patogênese complicada e patologias multi-alvo de doenças sistêmicas e reduziu a dificuldade em identificar intervenções relevantes para atingir tais complexidades. As tecnologias ‘- omic ‘ em biologia de sistemas têm sido amplamente utilizadas para correlacionar e elucidar múltiplos alvos e rede de doenças humanas e ações de drogas . O conceito de Farmacologia em rede é especialmente útil para traduzir e interpretar com precisão os efeitos terapêuticos dos medicamentos fitoterápicos em significados bioquímicos e biológicos modernos. Os medicamentos fitoterápicos podem servir como recursos valiosos para a descoberta de medicamentos multi-alvo baseados em rede. O conceito de Farmacologia em rede é especialmente útil para traduzir e interpretar com precisão os efeitos terapêuticos dos medicamentos fitoterápicos em significados bioquímicos e biológicos modernos. A eficácia dos medicamentos multi-alvo a partir de extratos de ervas é desenvolvida, seguida pela identificação de seus principais componentes bioativos e pelo redesenvolvimento de formulações multi-componentes completamente novas, compostas pelos principais componentes bioativos, a fim de alcançar uma combinação sinérgica e ideal .

combinar química de produtos naturais e abordagens metabolômicas na descoberta de medicamentos é uma nova estratégia para descobrir novos medicamentos. Existem poucos relatos na literatura científica, que discutem o uníssono das abordagens clássicas de química de produtos naturais com metabolômica para identificar novos produtos naturais bioativos. Estes geralmente se concentraram no estudo das plantas . A identificação de produtos naturais bioativos a partir de plantas continua sendo uma tarefa multifacetada devido à sua alta diversidade química e complexidade. Ao medir o metaboloma de diferentes extratos ou frações de uma planta e combinar esses dados com sua atividade biológica correspondente, sinais relacionados aos compostos relacionados à atividade exibida podem ser potencialmente determinados. Biologia de sistemas é um campo promissor abrangente de ferramentas no pós-revolução genômica, tais como a transcrição omicas, proteômica, glycomics e fluxomics com a intenção de caracterizar todos os genes e produtos de células completamente inclusiva de mRNA, proteínas, glycan estruturas e metabólitos. A metabolômica visa construir observações equilibradas usando ferramentas altamente reproduzíveis seguidas pela análise de dados para localizar as correlações entre os dados disponíveis. A criação de perfis de todos os metabólitos de baixo peso molecular de um organismo não é possível e, portanto, esse campo emergente de metabolomics combina química analítica, bioquímica e biologia computacional, permitindo a análise de milhares de metabólitos em qualquer sistema biológico. As principais plataformas analíticas são a espectrometria de massa com cromatografia gasosa( MS-GC), cromatografia líquida (LC) ou eletroforese capilar (CE) e espectroscopia de RMN. Um procedimento equilibrado da extração para extrair eficientemente todos os metabolitos preliminares e secundários dos tecidos e dos líquidos de corpo é usado para obtê-los no formulário natural antes da análise nos vários solventes usados. O metabólito procedimentos de extração são mais complicados e complexos, devido à natureza diversificada de pequenas moléculas presentes e, devido à indisponibilidade de uma única técnica analítica e a plataforma que ajuda na análise de todos os metabólitos simultaneamente. Várias técnicas e metodologias de separação precisam ser aplicadas para obter uma análise completa dos metabólitos . A análise simultânea de centenas de compostos é obtida por várias ferramentas em informática que extraem informações dos dados, removendo o ruído de fundo, detecção e integração de Picos em grandes conjuntos de dados e normalizando e transformando as matrizes de dados resultantes antes de qualquer análise estatística . A metabolômica tem um acesso restrito à capacidade de identificar os sinais em relação à natureza química. Cerca de 60 a 80% de todos os compostos detectados são desconhecidos até hoje e a disciplina metabólica criou uma grande massa de biblioteca espectral de RMN para resolver esse problema. Estas estruturas secundárias desconhecidas do metabolito podem ser um entre os recursos não descobertos dos produtos naturais, das impressões digitais, da impressão do pé, do perfilamento ou das análises do alvo são termos comuns usados neste campo. A impressão digital visa tirar um “instantâneo” do organismo onde os sinais não podem necessariamente ser usados para detectar/identificar metabólitos específicos e dependem fortemente da técnica utilizada. Os sinais são atribuídos a um metabólito, independentemente de sua natureza, para ser um composto conhecido ou novo. O termo target analysis visa determinar e quantificar um metabólito específico de interesse .

O microarray é uma nova tecnologia desenvolvida recentemente que capacitou a comunidade científica para compreender os aspectos fundamentais sublinhando o crescimento e desenvolvimento da vida, bem como para explorar as causas genéticas de anomalias que ocorrem no funcionamento do corpo humano.A tecnologia de microarray de DNA pode analisar e comparar mudanças no DNA ou na proteína. Uma mudança cromossômica em um indivíduo anormal pode ser identificada quando o DNA desse indivíduo é comparado com o DNA (controle) de um indivíduo saudável. É muito preciso e útil na medida em que é capaz de detectar mudanças muito menores em comparação com a técnica de cariotipagem convencional. Esta técnica competente permitiu-nos compreender os aspectos elementares que sublinham o crescimento e o desenvolvimento da vida, bem como explorar as causas genéticas das anomalias que ocorrem no funcionamento do corpo humano. A tecnologia do Microarray foi utilizada extensivamente na farmacogenômica onde a análise comparativa dos genes de uma pilha insalubre e normal ajudará a identificação da Constituição bioquímica das proteínas sintetizadas pelos genes anormais/insalubres. As informações obtidas a partir da análise, em seguida, poderia ser utilizado para a síntese e concepção de drogas que combatem as proteínas anormais e reduzir o seu efeito .Kwon e seus colegas desenvolveram um in vitroapproach utilizando um sistema de Microarray contendo várias enzimas para síntese de alto rendimento de Produto Derivado de polipeptídeo e sua subsequente triagem de biblioteca completa baseada em poliquetídeo da tirosina quinase humana (TK), em um único microarray de vidro. Espera-se que os inibidores de TK tratem leucemia mielóide crônica, tumores estromais gastrointestinais e câncer de mama .

um programa de descoberta de drogas visa encontrar novos produtos naturais bioativos, que possuem alguma forma de atividade biológica potente. No entanto, o isolamento de produtos naturais conhecidos e indesejáveis sem interesse farmacológico ou químico é inevitável. O termo desreplicação, que é um processo de identificação de compostos conhecidos responsáveis pela atividade de um extrato antes do isolamento guiado por bioensaio, torna-se popular entre os pesquisadores de produtos naturais . As estratégias de deseplicação geralmente envolvem uma combinação de bioensaio, ciência da separação, métodos espectroscópicos e pesquisa de banco de dados e podem ser consideradas como processos de triagem química ou biológica. Existem várias maneiras pelas quais os programas de produtos naturais abordam a desreplicação, que se baseia na disponibilidade de métodos/instrumentação de triagem, tempo e custo para identificar possíveis “leads biológicos ou novos compostos” de um extrato bruto. Atualmente, existem muitas metodologias e protocolos avançados que distinguem novas entidades de compostos naturais conhecidos em um estágio inicial de um programa de descoberta de medicamentos ou em uma estratégia de isolamento de produtos naturais . O processo de deseplicação pode ser feito facilmente rastreando os compostos através dos bancos de dados disponíveis comercialmente, reduzindo o tempo necessário para a elucidação da estrutura de compostos conhecidos. Um exemplo é o de Chapman e Hall Dicionário de Produtos Naturais ; O Dicionário da Marinha de Produtos Naturais (on-line) (subconjunto do Dicionário de Produtos Naturais) com mais de 30, 000 compostos ; MarinLit – Marinho Produtos Naturais Banco de dados contendo atualizado de dados bibliográficos sobre os organismos marinhos com o número de referências a partir de 1, 200 revistas/livros e dados para ~21, 000 compostos ; AntiMarin é um banco de dados mais recente, no qual o número de grupos metil, o número de SP3-hibridizado metileno ou metina prótons, alceno, acetal, éter e formil grupos podem ser pesquisados . Além disso, a SciFinder Scholar e SCOPUS são pesquisas importantes ferramentas de descoberta (Chemical Abstracts on-line) e NAPRALERTTM é um banco de dados de todos os produtos naturais, incluindo etnomédico informações, farmacológico/bioquímico informações de extratos de microrganismos in vitro, in situ, in vivo, em humanos (relatos de caso, de não-clínicos) e estudos clínicos . A disponibilidade dessas bases de dados científicas, como as mencionadas nas instituições de pesquisa e acadêmicas, é um passo fundamental e crucial em um programa de produtos naturais bem governado. Com o aumento do número de novos alvos de drogas, métodos computacionais, como triagem virtual de alto rendimento, ferramentas de encaixe de ligante, perfil ADME (absorção, distribuição, metabolismo e excreção) e outras ferramentas e softwares computacionais modernos foram aplicados para acelerar o processo de descoberta de drogas. Algumas das bibliotecas e bancos de dados comuns de produtos naturais, conforme listadas abaixo, permitem que a triagem imediata de um grande número de compostos naturais seja feita em curto período de tempo contra uma variedade de alvos de drogas. Dicionário de produtos naturais (http://dnp.chemnetbase.com/intro/index.jsp); banco de dados de produtos naturais marinhos UCSD (http://naturalprod.ucsd.edu/); alerta de produtos naturais (http://napralert.org/) ;zinco (http://zinc.docking.org/browse/catalogs/natural-products) ; InterBioScreen (http://www.ibscreen.com/products.shtml); descoberta analítica (http://www.ac-discovery.com/);preservação da diversidade Molecular Internacional (http://www.mdpi.org/). Modelos gerados por computador de proteínas, incluindo as novas enzimas e receptores de alvos além da proteína de estruturas cristalinas que são depositados no Protein Data Bank (http://www.pdb.org/) pode ser facilmente gerado por homologia de modelagem, posteriormente, pelo simples molecular de ancoragem para examinar as interações entre os compostos naturais e os alvos de proteína. Os bioensaios podem então ser conduzidos seletivamente nos hits naturais ou nos leads recuperados sem as neccesidades de desperdiçar a preciosa quantidade dos compostos e evitar métodos experimentais caros e demorados. Exemplos de softwares de encaixe molecular atualmente disponíveis são AutoDock, AutoDockVina, FlexX, FRED, GOLD, eHiTS e localizadores de chumbo. Alguns exemplos usando triagem virtual de alto rendimento, incluindo o trabalho de Wang et al. onde dez compostos naturais foram identificados com sucesso como inibidores da flacipaína-2 (FP-2) e Liu et al. quem identificou um inibidor natural da dimerização STAT3 semelhante a um produto por triagem virtual baseada em estrutura .

Outras ferramentas de Bioinformática, como ligante e triagem de farmacóforo à base de estrutura, também foram relatadas como bem-sucedidas na assistência ao processo de descoberta de medicamentos a partir de produtos naturais. Chen et al. propuseram um modelo de farmacóforo de relação estrutura-atividade quantitativa de três dimensões baseado em inibidores conhecidos de mTOR. A triagem Virtual usando o melhor modelo de farmacóforo recuperou com sucesso 20 produtos naturais como potenciais inibidores de mTOR. Também é importante mencionar aqui que a partir do estudo anterior por Damon mostrou que dos 365 moléculas sugerido por encaixe, 127 (34.8%) deles inibiu a atividade da enzima proteína tirosina fosfatase-1B (PTP1B), enquanto apenas 85 (0.021%) de, aproximadamente, 400, 000 moléculas foram recuperados a partir de alta taxa de transferência de ensaio. Isso é cerca de 1700 vezes o enriquecimento da taxa de acerto do encaixe baseado na estrutura sobre a triagem aleatória .Por outro lado, a incorporação de chemoinformatic ferramentas na descoberta de medicamentos a partir de produtos naturais permitir que os compostos a serem analisadas para a sua ADMET (absorção, distribuição, metabolismo, excreção e toxicidade), propriedades antes de serem matriculados em quaisquer programas de desenvolvimento de medicamentos. A triagem de compostos naturais usando a “regra de 5” da Pfizer permite que os pesquisadores removam quaisquer moléculas que não obedeçam às regras. Uma vez que essas regras foram obtidas a partir de um conjunto de observações experimentais de milhares de droga e da droga-como moléculas, uma formação de medicamentos-farmácia/bioquímica pode facilmente utilizar o silicodata como um guia para determinar o potencial de droga-como compostos naturais, seguida pela síntese de novos análogos para que eles não teriam uma favorável droga-como propriedades. Uma boa molécula semelhante a uma droga em geral obedece às seguintes regras (i) peso molecular ≤ 500, (ii) logP calculado ≤ 5, (iii) número de doadores de ligações de hidrogênio ≤ 5 e (iv) número de aceitadores de ligações de hidrogênio ≤ 10. A introdução de instalações de silicoscreening e produtos naturais para triagem de alto rendimento em laboratórios acadêmicos, bem como em empresas farmacêuticas, reduz o custo da triagem aleatória de coleções muito grandes de compostos. A triagem Virtual in silicoor ajuda a filtrar o número de compostos usados em telas reais . Por outro lado, bioinformatic ferramenta, tais como o Dicionário de Produtos Naturais fornece informação estrutural sobre 150, 000 compostos diferentes que podem ser usadas em virtual de rastreio, mesmo que os compostos ainda teria que ser fisicamente disponível para qualquer atividade prevista para ser confirmado através de testes em um ensaio relevante. Finalmente, o agrupamento de andaimes quimicamente relacionados pode ser muito útil para orientar a síntese de novos compostos, mas obviamente há um atraso e despesa na síntese.

uma colaboração acadêmica estabeleceu o portal de descoberta de drogas (ver http:// www.ddp.strath.ac.uk/) na tentativa de combinar as técnicas de triagem virtual de produtos naturais quimicamente diversos e seus análogos sintéticos com a rápida disponibilidade de amostras físicas para teste, isso permite uma ampla variedade de compostos de laboratórios acadêmicos em muitas instituições diferentes em um banco de dados que pode ser usado para triagem virtual. Grupos de biologia acadêmica também propõem novas e novas estruturas proteicas como alvos para triagem virtual com o banco de dados do Portal (e com bancos de dados convencionais disponíveis comercialmente). Quando os hits são previstos a partir do in silicoscreening, os compostos podem ser obtidos a partir do químico originário para testes confirmatórios. Muitas vezes, há um link imediato para a experiência para a preparação de análogos para ajudar a iniciar um programa de otimização de leads. No entanto, o acesso ao Portal está disponível gratuitamente para o grupo Acadêmico. A expansão contínua do banco de dados químico significa que há uma cobertura valiosa e crescente do espaço químico de muitos novos compostos químicos. Embora os compostos no banco de dados do Portal geralmente já tenham sido divulgados em uma tese ou em um diário de química, muito poucos deles foram testados anteriormente para atividade biológica. Esta é uma característica comum de produtos naturais conhecidos: das 150.000 estruturas no dicionário CRC de produtos naturais, apenas 1% delas foram investigadas. A introdução de tecnologias metabolômicas em processos naturais de descoberta de produtos será benéfica em vários níveis. Ao aumentar o número de identificações em nossos dados metabolômicos, compostos com novas estruturas podem ser facilmente obtidos e testados para qualquer doença sob investigação. Além disso, a análise multi-paralela usando tecnologias metabolômicas também aumentará o rendimento dos processos de caracterização química de muitas espécies diferentes dos recursos naturais. Uma vez que Químicos de produtos naturais coletaram uma vida inteira de bibliotecas compostas de compostos puros ativos e também inativos, esses dados podem ser usados para construir as bibliotecas espectrais de massa e NMR espectrais, sem dúvida, ajudam as interpretações biológicas dos dados metabolômicos a serem feitas com menos dificuldade. Os avanços na instrumentação analítica e hifenização sofisticada de técnicas de separação com detectores de alta sensibilidade permitiram uma maior detecção de compostos de moléculas pequenas mensuráveis em sistemas biológicos (ou seja, metabólitos primários e secundários). Essas tecnologias podem ser usadas para promover a descoberta da química de produtos naturais para identificar potenciais novos candidatos a medicamentos que ajudarão a sustentar a saúde e a luta contra doenças e doenças. No caso de RMN de extratos brutos, os padrões podem ser facilmente visualizados e interpretados usando a análise de dados multivariada. Isso pode ser realizado de maneira comparativa, distinguindo diferenças entre extratos relativamente semelhantes ou pode ser associado a uma atividade biológica específica (geralmente in vitro). Em última análise, isso permite a construção de um banco de dados complexo do metaboloma .

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