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液体クロマトグラフィーとは何ですか?

液体クロマトグラフィー(LC)は、溶液中の化学成分の混合物を分離して分析し、特定の成分が存在するか存在しないか、存在する場合はその量を決定 私たちの多くは、ろ紙に黒いインクマークを作り、水に最後を浸し、水が紙を浸すにつれてインク内の成分の色が分離するのを見て、私たちの学校の日から平面LCの形に精通しているでしょう。 しかし、分析用途で使用されるLCの大部分は、ここでの焦点となるカラムクロマトグラフィーに基づいています。 高性能液体クロマトグラフィー(HPLC)は、名前が提案するように、高いクロマトグラフの決断の高性能の分離に使用する高性能変形です。 分離された成分はまた、画分収集器を使用して、精製の手段として検出後に単離されてもよい。 HPLCはいろいろ異なった構成で利用でき、数万のキロダルトンの大きい蛋白質の生体分子まで分子量で及ぶ分解された部品の分離のために使用され 液体クロマトグラフィーは、環境モニタリング、食品安全保障、化学産業における品質管理から、新生児スクリーニングを含む臨床診断に至るまで、多くの用途に使用される非常に一般的な分析技術です。

液体クロマトグラフィーはどのように機能しますか?

液体クロマトグラフにはさまざまなシステム構成が用意されており、超高速液体クロマトグラフィー(UHPLC)装置で最高効率の分離が実行されていますが、この技術は2004年に最初に製品化され、ultra performance liquid chromatography(UPLC)と呼ばれていました。 要するに、液体移動相に可溶性の多成分混合物は、移動相(図1(1))と静止相(カラム)との間の個々の成分のユニークな分配のために分離される(図1(3))。

移動相、典型的には溶媒は、高圧ポンプの助けを借りてシステムを介してサンプルを輸送するために使用されます(図1(1))。 但し、それはまた分離プロセスの重大な役割を担います。

少量のサンプル(1-100μ l)をサンプルループ(図1(2))にロードし、六つのポートバルブによって移動相フローに注入すると、クロマトグラフ実行が開始されます。 サンプルが注入されると、移動相がカラムにポンピングされます(図1(3))。 いろいろなコラムの長さ(30から250のmm)および内部直径(1から4.6mm)は一緒にコラムの効率および選択率を定義する粒度(1.5から10ミクロンの直径)および相違の活動の静止した段階の吸着剤材料と詰まる利用できる。 コラムはコラムのオーブンにあります;より高い温度(45º C)で線形速度を増加する移動相の粘着性は減ります。 これはそれからランタイムを減らし、またクロマトグラフの決断を改善する。

移動相との親和性が高い混合物中の成分は、固定相との相互作用がほとんどなく、迅速にカラムを通って移動します。 成分のバンドがカラムから出たり溶出したりすると、検出器(図1(4))は成分の濃度に比例する応答を与えます。 注入と検出の間にかかる時間は、保持時間として知られている。 成分の保持時間は、所定のセットのクロマトグラフ条件に対して非常に特異的であり、同定のための標準の保持時間と比較することができる。

逆相クロマトグラフィーの場合、極性の低い分析物は非極性の静止相に優先的に分配され、保持時間が長くなります。 データ収集システム(図1(5))は、クロマトグラムの保持時間の関数として検出器の応答を記録します。 クロマトグラム(図2)に記録されたピークは、通常、サンプル中に存在する成分の濃度に比例するピーク面積を決定するために統合されています。

図1:質量分析計(LC-MS)にハイフネーションされた液体クロマトグラフの簡略図:(1)移動相用バイナリポンプ、(2)オートサンプラー6ポートバルブおよびインジェクタループ、(3)カラム付きカラムヒーター、(4)質量分析計検出器、(5)PC。 クレジット:アンシアスコンサルティング。

オートサンプラーがサンプルを移動相に注入した後、分離プロセスがカラムで実行されます。 クロマトグラフィーシステムの選択性はクロマトグラフィ分解能に最大の影響を与え、調査中のアプリケーションとコンポーネントに合わせて調整する必要があります。 選択性は、移動相(異なる溶媒)または固定相に存在する特定の化学官能基(カラムタイプを変更する)の溶離性強度を変更することによって変更するこ

図2: HPLCまたはLC-MSからのクロマトグラム出力Credit:Anthias Consulting

移動相を考慮すると、液体クロマトグラフを実行するときに選択する主な操作モード、すなわちisocraticまたはgradient。 アイソクラティック法は、選択性の変化なしにクロマトグラフ実行の持続時間のために同じ移動相組成を使用します。 勾配法は、移動相組成を時間の関数として変化させることを可能にし、これは通常、クロマトグラフ分解能を増加させるか、または実行時間を短縮

カラム内に固定化された固定相の化学的性質は、この技術の選択性に影響を与える。 逆相HPLCまたはUHPLC1は、最も一般的なシステム構成であり、オクタデシルシラン(ODSまたはC18)などの非極性固定相、および極性移動相(水/メタノール)を使用する。 他の逆相定常相には、極性の低い分析物の保持時間が対応して短いC18よりも疎水性が低いオクタシラン(C8)が含まれる。 フェノール置換基で官能化されたカラムが使用される場合、これは、それらの親和性の増加によるフェノール成分の保持を増加させる;likeはlikeを引き付ける。

移動相のpHはイオン成分の保持時間に大きな影響を及ぼし、これは方法開発プロセス中に活用されるべきである。 緩衝液2は、移動相のpHをイオン成分のpKa以下に維持するために使用することができ、イオン成分のpkaはその解離平衡を中性形態にシフトさせる。 成分の中性形態は極性が低くなるため、その保持時間を制御することができる。

通常相クロマトグラフィーは、その極性に基づいて分析物を分離する別のLC法であり、実際には逆相液体クロマトグラフィーの導入前に開発されたが、あまり普及していない。 定常相は通常の相クロマトグラフ3では極性であり、移動相は非極性である。 これにより、システムの保持特性が変化し、混合物の非極性成分が最短の保持時間で最初に溶出する。 極性分析物は、固定相に対してより高い親和性を有し、より長い保持時間で後に溶出する。 イオンクロマトグラフィー、イオンペア、サイズ排除、親和性を含む利用可能な液体クロマトグラフィーの他のタイプがあり、リストは上に行く。 サイズ/形状または分子量に基づいて分析物を分離するサイズ排除クロマトグラフィーを除いて、言及されたLCの他の形態はすべて異なる移動相および 分離される成分の所与のセットに対して達成可能な選択性およびクロマトグラフ分解能は、使用される固定相および移動相によって定義される。

部品が分離されると、検出が必要になります。 探知器の選択は適用のための方法目的によって運転される;いろいろな選択は感受性、特定性、選択率および線形ダイナミックレンジのさまざまな 最も一般的な検出器は、特定の波長での光の吸光度を測定する紫外可視(UV-Vis)検出器です。 波長は分析されるべき部品のlambda maxに基づいて選ばれます探知器の応答はその特定の部品の集中に正比例しています。 成分がカラムから溶出すると、検出器のフローセル内の濃度が上昇および下降し、これがクロマトグラフィピークとしてプロットされます(図2参照)。 データ集録レートは、ピーク全体で少なくとも20個のデータポイントを集録するように設定する必要があります。 そう多くのクロマトグラフの技術と同じように、質量分析システムへのハイフネーションは通常利用できる選択の広い範囲との最もよい分析的な解

LCシステムの様々なコンポーネントを相互接続するために使用されるチューブの長さと内径は重要であり、絶対的な最小値に保つ必要があります。 クロマトグラフィーシステムの任意の部分は、注入ループの開始から検出器フローセルの終了まで、静止相ではないことが効率的な分離に寄与しない。 システム内のこの付加的な容積は空間の容積として知られています、空間内の分けられた部品の付加的な縦方向の拡散は感受性および減らされたクロ

HPLC

からのUHPLCの進化UHPLCの進化は、ますます複雑で困難なサンプルの高分解能分離に対するアナリストの絶え間ない要求によって部分的に駆動され クロマトグラフの性能のこのステップ変更を可能にした主要な進歩は狭い粒度分布のサブ2ミクロンの静止した段階の梱包材4の開発でした。

新しい粒子は、一般的に入手可能なHPLC固定相と同じ化学的機能を備えて製造され、同じ移動相を使用する場合にクロマトグラフィーシステムの選択性が維持されたことが保証された。 重要な性能の利点は新しい補助的な2ミクロンの梱包材を使用するとき与えられる高められた効率か版の計算によって実現された。

HPLC法をUHPLCシステムに移行する際には、実行時間の短縮、クロマトグラフ分解能の向上、感度の向上、溶媒消費の削減など、多くの利点があります。 新しいUHPLCのコラムを使用するためにはコラムのより小さい粒子によって出る高められた背圧を収容するために高圧で作動できるポンプを使用す 検出器フローセルはまた、カラムから溶出する成分の狭いバンドを検出するために必要な内部容積を小さくするためにアップグレードする必要があ また、ピーク全体に十分なデータポイントを確保するために、データ収集レートをそれに応じて増加させる必要があります。

液体クロマトグラフィー(LC-MS)への質量分析のハイフネーション)

質量分析は、非常に高い質量分解能を持つ計測器を使用する場合、その高い感度、リニアダイナミックレンジ、選択性、さらには特異性のために、液体クロマトグラフにハイフネーションすることができる最高の検出器であると考えられています。 質量分析の技術は、成分または分析物の質量対電荷比(m/z)を決定するために使用される。 ガスクロマトグラフィー-質量分析法(GC-M s)とは異なり,LCシステムのMSへのハイフネーションは容易ではなく,開発に多くの年を要した。 エレクトロスプレイイオン化(ESI)は、イオン化プロセスが大気圧で行われるLC-MSで今日使用される最も一般的なイオン化技術です。 それは達成することは困難だった質量分析システム内で必要な高真空への大気圧入口の開発でした。

どのようにLC-MS質量スペクトルを読んで、それはあなたに何を教えてくれますか?

エレクトロスプレイイオン化は非常に柔らかいイオン化技術であり、イオンの形成中に観察される断片化はほとんどないことを意味する。 LC−MSシステムは、プロトン化された分子+を生成する塩基性分析物のための正イオンモード、または脱プロトン化された分子−を生成する酸性分析物のための負イオンモードのいずれかで実行することができる。

標的分析物の特性評価または同定のためのより多くの情報を得るために、通常は衝突誘起解離(CID)によってエレクトロスプレー過程によって生成されたイ CIDは、第1のサンプリング又はスキマーコーンに印加される電位差を変化させることによってイオン源において、又は、イオンがアルゴンのような衝突ガ

図3は、混合物の分離された各成分について一連の特徴的なフラグメントイオンを生成するためのソース内衝突誘起解離を伴うフルスキャンLC-MS集 質量対電荷比(m/z)はx軸に沿ってプロットされ、イオンの強度または相対存在量はy軸に沿ってプロットされる。 図3上のz軸は、分離された成分の保持時間を表し、各ベースライン分解クロマトグラフィピークは、質量分析計によって一度に一つずつ分析され、主要な診断フラグメントイオンは、同定および標的イオン確認のために使用されてもよい。

図3:一連のフルスキャンLC-MS質量スペクトル、MSは情報の追加次元を追加します。 クレジット:アンシアスコンサルティング。

液体クロマトグラフィーを複数の次元にする

複雑な多成分混合物を扱う場合、個々のピークがカラムから溶出するように、各成分をベースライン解決することはできない場合があります。 方法の開発と最適化は、クロマトグラフ分解能が選択性の欠如のために利用できない場合、共溶出成分を分離するために代替選択性を有する追加のクロマトグラフィーカラムを使用する必要があるかもしれない、これまでのところあなたを得ることができます。

多次元クロマトグラフ5は、より適切な選択性を持つ代替クロマトグラフィーカラムに”ハートカット”によって共溶出成分を転用することを可能にし、個々の溶出成分に分離を解決することができる。 システムはより高いクロマトグラフの決断のそれに続く分離そして検出のための第一の次元またはコラムの共溶離のピークのポストの検出を第二の次元に単に転換する転換弁によって、セットアップされるかもしれない。

精製用セミ分取液体クロマトグラフィー

液体クロマトグラフィーシステムの寸法をスケールアップすることにより、内径が大きいカラムをより高流量 Semi-preparative chromatography6システムはサンプルのミリグラムの100’sと荷を積まれるかもしれません。 それらがコラムを離れて溶出すると同時に一部分のコレクターが別のガラスびんにクロマトグラフィピークを集めるのにそれから使用されています。 分画のコレクターはピークの開始を示すクロマトグラフィベースラインの変曲を捜す探知器によって誘発され分離された部品のピークは純粋な分画とし 次いで、単離された画分を、構造解明のための化合物を完全に特徴付けるために、核磁気共鳴(NMR)などの質量分析を補完する追加の分析技術に供するこ

液体クロマトグラフィーの強みと限界

LCは、多様な用途に日常的に使用されていますが、揮発性化合物の分離および分析には適していません。 堅牢な分析LC法は、分離されるすべての成分が移動相の蒸気圧よりも低い蒸気圧を有する場合にのみ実現することができる。 ガスクロマトグラフィーは、揮発性化合物の分析にはるかに適しています。

さまざまなカラムと溶媒の広範な配列が用意されており、幅広い選択性を提供し、幅広い極性を有する成分を分離することができます。 大分子および小分子は、この技術にも同様に従順である。 比較的低い温度で効率的な分離を行う能力はまた、ガスクロマトグラフで分解する可能性のある熱的に不安定な化合物のための理想的な分離技術

液体クロマトグラフィーの一般的な問題

サンプル調製は成功の鍵です; すべてのサンプルがオートサンプラーにロードされる前にフィルター処理されることは非常に重要です。 これはサンプルがろ過されなければコラムの補助的な2ミクロンの粒子を使用して高性能の分離が妨害に傾向があるUHPLCを使用するとき特に重要 特にバッファが使用される場合は、移動相にも同じことが当てはまります。

サンプルのための正しい注入または希釈剤の溶媒の使用は重大です、溶媒強さは移動相の開始条件のそれと同じまたはより少しべきです。 強すぎる溶媒が使用されると、ピーク分裂および再現性が低下することが観察される。 強すぎる洗浄溶媒がオートサンプラーで使用されている場合も同様の問題が観察されることがあります。

取得したクロマトグラムのベースラインの変動や保持時間の再現性の悪さは、ポンプ(図1(1))または真空脱気装置の問題が原因である可能性があります。 ポンプまたは真空脱気装置が十分に維持されていない場合、逆止弁が部分的に固着して圧力リップルを引き起こす可能性があります。 これらの問題は、予定外のダウンタイムとパフォーマンスの低下を防ぐために、製造業者のガイドラインに従って予防保守タスクが実行されることに

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