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L’Evoluzione del Ruolo di Prodotti Naturali dalle Foreste pluviali Tropicali come Rifornibile Fonte di Nuovo Farmaco Porta

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Moderni approcci nella scoperta della droga di prodotti naturali

L’arrivo di nuove tecnologie in spettrometria di massa, NMR e altre tecniche spettroscopiche, bimolecolare di destinazione o cell-based screening precoce colpito la caratterizzazione e l’utilizzo di metodi computazionali hanno migliorato l’impatto di prodotti naturali nel HTS a base di scoperta della droga. Gli estratti di prodotti naturali contengono spesso un gran numero di costituenti che comprendono quelli, che sono difficili da separare. Le strutture univoche dei composti puri possono essere determinate dalla combinazione di tecniche convenzionali come la spettroscopia di assorbimento ultravioletto (UV), IR, MS e NMR. In rari casi, in cui vi è una difficoltà nel determinare la configurazione assoluta, viene utilizzata l’analisi a raggi X a cristallo singolo. Le tecniche di separazione convenzionali richiedono molto tempo e sono faticose. La sillabazione diretta di una tecnica di separazione competente con tecniche spettroscopiche efficienti come HPLC-FTIR può essere utilizzata per supportare il processo di dereplicazione . HPLC-FTIR è stato utilizzato per rilevare gruppi funzionali nei principali costituenti delle miscele, ma non ha trovato ampia applicazione a causa di limitazioni di compatibilità; cioè ottenere una separazione ottimale accompagnata da un’adeguata rilevazione .

Una delle nuove tecnologie nella scoperta di farmaci da prodotti naturali è l’uso dell’elettroforesi capillare (CE) nel programma di screening sviluppato per la prima volta da Cetek Corporation e Cubist. Il test è in grado di identificare composti/ estratti attivi di prodotto naturale e rilevando qualsiasi spostamento della proteina quando un ligando si lega ad esso a causa dei cambiamenti di carica conformazionale e superficiale. La tecnica CE può distinguere tra composti leganti deboli e forti negli estratti prima di determinarne la concentrazione . Questa tecnologia è stata applicata al programma interno della scoperta della droga di Cetek nella ricerca dei composti naturali novelli del prodotto che inibiscono l’obiettivo del cancro, HSP90, un chaperonin molecolare che è responsabile del mantenimento della piegatura e della stabilità corrette delle proteine . Un altro esempio interessante che è stato recentemente riportato da Wang, et al.ha dimostrato che un metodo CE in combinazione con cromatografia liquida-spettrometria di massa tandem (LC-MS/MS) è stato applicato con successo nello screening di estratti vegetali, identificato con successo un composto naturale chiamato baicalin da Radix scutellariacome una nuova proteina chinasi un inibitore . In un altro studio separato, Zhao e Chen, hanno sviluppato un microreattore capillare immobilizzato da neuraminidasi semplice ed efficace facbricated dalla tecnologia di reticolazione della glutaraldeide per lo screening degli inibitori della neuraminidasi dalle medicine tradizionali cinesi. Sei su diciotto prodotti naturali tra cui bavachinin, bavachin, baicalein, baicalin, chrysin e vitexin sono stati trovati come potenti inibitori dallo screening. Alcuni aspetti importanti di CE che meritano un riconoscimento in questo capitolo sono la sua facilità d’uso, versatilità e componenti di separazione ad alta risoluzione, alta efficienza di separazione e la sua bassa quantità di campione e consumo di reagenti.

Flow injection analysis-NMR (FIA-NMR) comprende un campione, che viene iniettato come spina in un flusso di fluido e poi spazzato nella bobina del rivelatore NMR. In un FIA-NMR, la fase mobile viene utilizzata come solvente a spinta idraulica che trasferisce il campione iniettato dalla porta dell’iniettore alla cella di flusso NMR. La scansione scout che viene utilizzata per determinare la posizione dei picchi di solvente viene ottenuta dallo spettrometro una volta che la pompa si arresta. Infine, un segnale viene inviato alla pompa solvente in modo che il vecchio campione dalla cella di flusso NMR possa essere scaricato . HPLC-NMR-MS è un nuovo e più avanzato metodo spettrometrico che viene utilizzato nella de-replicazione di estratti di prodotti naturali . Pur essendo il metodo più efficace, il vantaggio della suddetta metodologia sillabata è la corrispondenza dei dati MS allo spettro NMR. Inoltre, le informazioni dei gruppi funzionali (ad es., hydroxyl e ammino le parti) che sono consegnate dal HPLC-NMR è identificato prontamente dalle tecniche del ms. L’avvento di magneti a campo più alto e sonde crio aveva dimostrato che HPLC-NMR era uno strumento spettroscopico forte ed efficace e applicato agli estratti grezzi (NMR e profilo UV dal rilevamento HPLC PDA). C’è un significativo miglioramento nella sensibilità di profilatura e de-replicazione dei prodotti naturali a causa dell’utilizzo di magneti a campo più alto e dei recenti sviluppi della micro bobina HPLC-NMR e capillare NMR (CapNMR) che ha permesso di esaminare piccole quantità di campioni nell’ordine di 40-120 µL . Il micro coil HPLC-NMR è più adatto per HPLC-NMR online che utilizza gli esperimenti on flow, stop flow o time silencing per separare i componenti presenti in concentrazioni maggiori e analizzare gli stessi, mentre il capillare NMR utilizza i solventi non deuterati in una separazione HPLC off-line offrendo così una vasta gamma di solventi a basso costo. I composti isolati vengono nuovamente disciolti in solventi deuterati e quindi iniettati nella sonda di flusso CapNMR utilizzando volumi di circa 6 µL con spettri 1H-NMR acquisiti per quantità di campioni nell’ordine di 2-30 µg, aumentando così la sensibilità con la prospettiva di classificare i nuovi metaboliti secondari a basso livello .

Oltre a quanto sopra, le informazioni ottenute dagli spettri NMR 1D e 2D sono sufficienti per classificare i composti oltre a fornire un’istantanea “ad alta fedeltà” dei costituenti nell’estratto, fornendo così le informazioni che aprono la strada a decisioni razionali sul metodo di frazionamento superiore o per procedere ulteriormente all’isolamento. Molte pubblicazioni recenti sono state riportate utilizzando questo approccio .La tecnica e l’utilizzo di HPLC-NMR nell’identificazione/classificazione dei prodotti naturali è ben riconosciuta in letteratura, ma le applicazioni dei suoi usi si sono principalmente occupate solo della profilazione chimica delle piante . Numerose modalità di HPLC-NMR (principalmente modalità on-flow e stop-flow) combinano il potere risolutivo della cromatografia, che è interfacciato con la comprensione strutturale fornita da NMR. L’approccio riduzionista non ha avuto molto successo nella scoperta di farmaci efficaci per il trattamento di malattie complesse, come il cancro, le malattie metaboliche, cardiovascolari e neurologiche. I farmaci a bersaglio singolo non possono sempre indurre l’effetto desiderato all’intero sistema biologico anche se inibiscono o attivano con successo un bersaglio specifico.Ci sono limitazioni nell’uso dell’approccio riduzionista o mono-target nella scoperta di farmaci. L’approccio produce solo una comprensione limitata della patogenesi complicata e delle patologie multi-target di malattie sistemiche come tumori, malattie cardiovascolari e disturbi neurodegenerativi. Vi è difficoltà nell’individuare gli interventi pertinenti per mirare a tali complessità. L’intervento farmacologico basato su bullet o mono-target non può combattere efficacemente le complesse patologie delle malattie sistemiche in quanto sono regolate da complesse reti biologiche e dipendono da molteplici fasi di sfide genetiche e ambientali per progredire. Recentemente c’è un crescente interesse ad utilizzare approcci innovativi alla scoperta di farmaci da prodotti naturali da parte della farmacologia di rete che integra la biologia dei sistemi e la farmacologia . Il concetto multidisciplinare integrato di bersagli multipli, effetti multipli e malattie complesse nella farmacologia di rete ha arricchito la nostra comprensione della patogenesi complicata e delle patologie multi-target delle malattie sistemiche e ha ridotto la difficoltà nell’identificare interventi rilevanti per indirizzare tali complessità. Le tecnologie ‘- omiche ‘ nella biologia dei sistemi sono state ampiamente utilizzate per correlare e chiarire più obiettivi e reti di malattie umane e azioni farmacologiche . Il concetto di farmacologia di rete è particolarmente utile per tradurre e interpretare accuratamente gli effetti terapeutici delle medicine a base di erbe in moderni significati biochimici e biologici. I medicinali a base di erbe possono servire come risorse preziose per la scoperta di farmaci multi-target basati sulla rete. Il concetto di farmacologia di rete è particolarmente utile per tradurre e interpretare accuratamente gli effetti terapeutici delle medicine a base di erbe in moderni significati biochimici e biologici. L’efficacia dei farmaci multi-target da estratti di erbe sono sviluppati seguita da identificazione dei loro principali componenti bioattivi e riqualificazione di un completamente nuove formulazioni multi-componente composto dai principali componenti bioattivi al fine di raggiungere una combinazione sinergica e ottimale .

Combinare la chimica dei prodotti naturali e gli approcci di metabolomica nella scoperta dei farmaci è una nuova strategia per scoprire nuovi farmaci. Ci sono pochi rapporti nella letteratura scientifica, che discutono l’unisono degli approcci classici di chimica del prodotto naturale con metabolomics per identificare i prodotti naturali bioattivi novelli. Questi si sono generalmente concentrati sullo studio delle piante . L’identificazione di prodotti naturali bioattivi dalle piante rimane un compito multiforme a causa della loro elevata diversità chimica e complessità. Misurando il metaboloma di diversi estratti o frazioni di una pianta e combinando questi dati con la sua attività biologica corrispondente, i segnali relativi ai composti relativi all’attività visualizzata possono potenzialmente essere determinati. La biologia dei sistemi è un campo più promettente che comprende strumenti nella rivoluzione post-genomica come omica di trascrizione, proteomica, glicomica e fluxomica con l’intenzione di caratterizzare tutti i prodotti genici e cellulari completamente inclusivi di mRNA, proteine, strutture di glicano e metaboliti. Metabolomics mira a costruire osservazioni bilanciate utilizzando strumenti altamente riproducibili seguiti dall’analisi dei dati per individuare le correlazioni tra i dati disponibili. Il profiling di tutti i metaboliti a basso peso molecolare di un organismo non è possibile e quindi questo campo emergente della metabolomica combina chimica analitica, biochimica e biologia computazionale permettendo l’analisi di migliaia di metaboliti in qualsiasi sistema biologico. Le principali piattaforme analitiche sono la spettrometria di massa con gascromatografia (MS-GC), la cromatografia liquida (LC) o l’elettroforesi capillare (CE) e la spettroscopia NMR. Una procedura di estrazione bilanciata per estrarre efficacemente tutti i metaboliti primari e secondari dai tessuti e dai fluidi corporei viene utilizzata per ottenerli nella forma naturale prima dell’analisi nei vari solventi utilizzati. Le procedure di estrazione del metabolita sono più complicate e complesse a causa della natura diversificata delle piccole molecole presenti e per l’indisponibilità di una singola tecnica analitica e piattaforma che aiuta nell’analisi di tutti i metaboliti contemporaneamente. Diverse tecniche e metodologie di separazione devono essere applicate per ottenere un’analisi completa dei metaboliti . L’analisi simultanea di centinaia di composti è ottenuta da vari strumenti in informatica che estraggono informazioni dai dati, rimuovendo il rumore di fondo, il rilevamento e l’integrazione dei picchi attraverso grandi set di dati e normalizzando e trasformando le matrici di dati risultanti prima di qualsiasi analisi statistica . Metabolomics ha un accesso limitato alla capacità di identificare i segnali rispetto alla natura chimica. Circa il 60-80% di tutti i composti rilevati sono sconosciuti ancora oggi e la disciplina metabolica ha creato una grande massa di libreria spettrale NMR per affrontare questo problema. Queste strutture secondarie sconosciute del metabolita possono essere una fra le risorse non scoperte dei prodotti naturali, impronte digitali, stampa del piede, profilatura o analisi dell’obiettivo sono termini comuni usati in questo campo. Il Fingerprinting mira a scattare una “istantanea” dell’organismo in cui i segnali non possono necessariamente essere utilizzati per rilevare/identificare metaboliti specifici e dipende fortemente dalla tecnica utilizzata. I segnali sono assegnati ad un metabolita indipendentemente dalla sua natura di essere un composto noto o nuovo. Il termine target analysis mira a determinare e quantificare uno specifico metabolita di interesse .

Il microarray è una nuova tecnologia recentemente sviluppata che ha permesso alla comunità scientifica di comprendere gli aspetti fondamentali che sottolineano la crescita e lo sviluppo della vita, nonché di esplorare le cause genetiche delle anomalie che si verificano nel funzionamento del corpo umano.La tecnologia DNA microarray può analizzare e confrontare i cambiamenti nel DNA o nelle proteine. Un cambiamento cromosomico in un individuo anormale potrebbe essere identificato quando il DNA da questo individuo è confrontato con il DNA (controllo) da un individuo sano. È molto preciso e utile in quanto è in grado di rilevare cambiamenti molto più piccoli rispetto alla tecnica di cariotipo convenzionale. Questa tecnica competente ci ha permesso di comprendere gli aspetti elementali che sottolineano la crescita e lo sviluppo della vita, nonché di esplorare le cause genetiche delle anomalie che si verificano nel funzionamento del corpo umano. La tecnologia Microarray è stata ampiamente utilizzata in farmacogenomica dove l’analisi comparativa dei geni da una cellula malsana e da una normale aiuterà l’identificazione della costituzione biochimica delle proteine sintetizzate dai geni anormali/malsani. Le informazioni ottenute dall’analisi potrebbero quindi essere utilizzate per la sintesi e la progettazione di farmaci che combattono le proteine anormali e riducono il loro effetto .Kwon ei suoi colleghi hanno sviluppato un approccio in vitroapproccio utilizzando un sistema di microarray contenente multi-enzima per la sintesi ad alto throughput del prodotto derivato dal polipeptide e il loro successivo screening completo della libreria basata sul polichetide della tirosina chinasi umana (TK), su un singolo microarray di vetro. Ci si aspetta che gli inibitori della TK curino la leucemia mieloide cronica, i tumori stromali gastrointestinali e il cancro al seno .

Un programma di scoperta di farmaci mira a trovare nuovi prodotti naturali bioattivi, che possiedono una qualche forma di potente attività biologica. Tuttavia l’isolamento di prodotti naturali noti e indesiderabili senza alcun interesse farmacologico o chimico è inevitabile. Il dereplication di termine che è un processo di identificazione dei composti conosciuti responsabili dell’attività di un estratto prima dell’isolamento bio-guidato diventa popolare fra i ricercatori dei prodotti naturali . Le strategie di dereplicazione generalmente comportano una combinazione di analisi biologica, scienza della separazione, metodi spettroscopici e ricerca di database e possono essere considerate come processi di screening chimici o biologici. Esistono diversi modi in cui i programmi di prodotti naturali si avvicinano alla dereplicazione, che si basa sulla disponibilità di metodi/strumentazione di screening, tempi e costi per identificare possibili “derivazioni biologiche o nuovi composti” da un estratto grezzo. Attualmente esistono molte metodologie e protocolli avanzati che distinguono nuove entità da composti naturali noti in una fase iniziale di un programma di scoperta di farmaci o in una strategia di isolamento del prodotto naturale . Il processo di dereplicazione può essere fatto facilmente vagliando i composti attraverso i database disponibili in commercio, riducendo il tempo necessario per la delucidazione della struttura dei composti noti. Un esempio è il Dizionario Chapman e Hall dei prodotti naturali ; Il Dizionario dei prodotti naturali marini (on-line) (sottoinsieme del Dizionario dei prodotti naturali) contenente oltre 30.000 composti ; MarinLit – Il database dei prodotti naturali marini contenente dati bibliografici aggiornati sugli organismi marini con il numero di riferimenti da 1.200 riviste / libri e dati per ~21.000 composti ; AntiMarin è un database più recente, in cui è possibile cercare il numero di gruppi metilici, il numero di metilene ibridato sp3 o protoni metinici, gruppi alchenici, acetali, eteri e formilici . Inoltre, SciFinder Scholar e SCOPUS sono importanti ricerche di strumenti di rilevazione (Chemical Abstracts on-line) e NAPRALERTTM è un database di tutti i prodotti naturali, tra cui etnomedici informazioni, farmacologici/informazioni biochimiche di estratti di organismi in vitro, in situ, in vivo, nell’uomo (case report, gli studi non-clinici) e studi clinici . La disponibilità di questi database scientifici come quelli menzionati alle istituzioni di ricerca e accademiche, è un passo fondamentale e cruciale in un programma di prodotti naturali ben governato. Con l’aumento del numero di nuovi target di farmaci, sono stati applicati metodi computazionali come lo screening virtuale ad alto throughput, gli strumenti di docking dei ligandi, la profilazione ADME (assorbimento, distribuzione, metabolismo ed escrezione) e altri moderni strumenti e software computazionali per accelerare il processo di scoperta dei farmaci. Alcune delle librerie di prodotti naturali comuni e banche dati come elencati di seguito consentono lo screening rapido di un gran numero di composti naturali da fare in breve periodo di tempo contro una varietà di bersagli farmacologici. Dizionario dei prodotti naturali (http://dnp.chemnetbase.com/intro/index.jsp); UCSD Marine Natural Products Database (http://naturalprod.ucsd.edu/); Natural Products Alert (http://napralert.org/) ;ZINCO (http://zinc.docking.org/browse/catalogs/natural-products) ; InterBioScreen (http://www.ibscreen.com/products.shtml); AnalytiCon Discovery (http://www.ac-discovery.com/);Molecular Diversity Preservation International (http://www.mdpi.org/). Modelli generati al computer di proteine tra cui nuovi bersagli enzimatici e recettoriali oltre alle strutture cristalline proteiche che si depositano nella Banca dati proteica (http://www.pdb.org/) possono essere facilmente generati mediante modellazione omologica seguita successivamente da un semplice docking molecolare per esaminare le interazioni tra i composti naturali e i bersagli proteici. I saggi biologici possono quindi essere condotti selettivamente sui risultati naturali o sui lead recuperati senza la necessità di sprecare la preziosa quantità dei composti ed evitare metodi sperimentali costosi e dispendiosi in termini di tempo. Esempi di software di docking molecolare attualmente disponibili sono AutoDock, AutoDockVina, FlexX, FRED, GOLD, eHiTS e Lead finders. Alcuni esempi utilizzando high throughput screening virtuale tra cui il lavoro di Wang et al. dove dieci composti naturali sono stati identificati con successo come inibitori di flacipain-2 (FP-2) e Liu et al. chi ha identificato un inibitore naturale di dimerizzazione STAT3 del tipo di prodotto da screening virtuale basato sulla struttura .

Altri strumenti bioinformatici come il ligando e lo screening farmacoforo basato sulla struttura sono stati anche segnalati per avere successo nell’assistere il processo di scoperta di farmaci da prodotti naturali. Chen et al. hanno proposto un modello farmacoforo di relazione struttura-attività quantitativa a tre dimensioni basato su inibitori noti di mTOR. Lo screening virtuale utilizzando il miglior modello di farmacoforo ha recuperato con successo 20 prodotti naturali come potenziali scaffold di inibitori mTOR. È anche importante menzionare qui che dal precedente studio di Doman ha dimostrato che su 365 molecole suggerite dall’attracco, 127 (34,8%) di esse hanno inibito l’attività della proteina enzimatica tirosina fosfatasi-1B (PTP1B) mentre solo 85 (0,021%) su circa 400.000 molecole sono state recuperate da un test sperimentale ad alto rendimento. Questo è circa 1700 volte l’arricchimento del tasso di successo dall’attracco basato sulla struttura rispetto allo screening casuale .D’altra parte, l’incorporazione di strumenti chemioinformatici nella scoperta di farmaci da prodotti naturali consente ai composti di essere sottoposti a screening per le loro proprietà ADMET (assorbimento, distribuzione, metabolismo, escrezione e tossicità) prima di essere arruolati in qualsiasi programma di sviluppo di farmaci. Lo screening di composti naturali utilizzando la ‘Regola del 5’ di Pfizer consente ai ricercatori di rimuovere eventuali molecole che non obbediscono alle regole. Poiché queste regole sono state derivate da una serie di osservazioni sperimentali di migliaia di farmaci noti e molecole simili a farmaci, un chimico/biochimico medicinale addestrato può facilmente utilizzare i silicodati come guida nel determinare i potenziali composti naturali simili a farmaci seguiti dalla sintesi di ulteriori analoghi in modo che abbiano proprietà favorevoli simili a farmaci. Una buona molecola simile al farmaco in generale obbedisce alle seguenti regole (i) peso molecolare ≤ 500, (ii) logP calcolato ≤ 5, (iii) numero di donatori di legame idrogeno ≤ 5 e (iv) numero di accettori di legame idrogeno ≤ 10. L’introduzione di in silicoscreening e strutture di prodotti naturali per lo screening ad alta produttività nei laboratori accademici e nelle aziende farmaceutiche riduce i costi derivanti dallo screening casuale di collezioni di composti molto grandi. In silicoor lo screening virtuale aiuta a filtrare il numero di composti utilizzati negli schermi reali . D’altra parte, lo strumento bioinformatico come il Dizionario dei prodotti naturali fornisce informazioni strutturali su 150.000 diversi composti che potrebbero essere utilizzati nello screening virtuale, anche se i composti dovrebbero ancora essere fisicamente disponibili per qualsiasi attività prevista da confermare attraverso test in un test pertinente. Infine, il clustering di scaffold chimicamente correlati può essere molto utile per guidare la sintesi di nuovi composti, ma ovviamente c’è un ritardo e una spesa nella sintesi.

Una collaborazione accademica ha istituito il Drug Discovery Portal (vedi http:// www.ddp.strath.ac.uk/) nel tentativo di combinare le tecniche di screening virtuale di prodotti naturali chimicamente diversi e dei loro analoghi sintetici con la rapida disponibilità di campioni fisici per i test, Ciò consente un’ampia varietà di composti provenienti da laboratori accademici in molte istituzioni diverse in un database che può essere utilizzato per lo screening virtuale. I gruppi di biologia accademica propongono anche nuove e nuove strutture proteiche come obiettivi per lo screening virtuale con il database del Portale (e con i database convenzionali disponibili in commercio). Quando i colpi sono previsti dal in silicoscreening, i composti possono essere ottenuti dal chimico originario per i test di conferma. Spesso, c’è un collegamento immediato alle competenze per la preparazione di analoghi per aiutare ad avviare un programma di ottimizzazione dei lead. Tuttavia, l’accesso al Portale è liberamente disponibile per il gruppo accademico. La continua espansione del database chimico significa che c’è una copertura preziosa e crescente dello spazio chimico di molti nuovi composti chimici. Sebbene i composti presenti nel database del Portale siano generalmente già stati divulgati in una tesi o in una rivista di chimica, pochissimi di essi sono stati precedentemente testati per l’attività biologica. Questa è una caratteristica comune dei prodotti naturali noti: delle 150.000 strutture nel Dizionario CRC dei prodotti naturali solo l ‘ 1% di esse è stato studiato. L’introduzione di tecnologie metabolomiche nei processi di scoperta di prodotti naturali sarà utile a più livelli. Aumentando il numero di identificazioni nei nostri dati di metabolomica, i composti con nuove strutture possono essere facilmente ottenuti e testati per qualsiasi malattia in esame. Inoltre, l’analisi multi-parallela che utilizza tecnologie di metabolomica migliorerà anche il rendimento dei processi di caratterizzazione chimica di molte specie diverse dalle risorse naturali. Poiché i chimici del prodotto naturale hanno raccolto una vita delle librerie composte dei composti puri attivi ed anche inattivi, questi dati possono essere usati per costruire le librerie spettrali spettrali di massa e di NMR, indubbiamente aiutano le interpretazioni biologiche dei dati di metabolomics da fare con meno difficoltà. I progressi nella strumentazione analitica e la sillabazione sofisticata delle tecniche di separazione con rivelatori ad alta sensibilità hanno permesso una maggiore rilevazione di composti di piccole molecole misurabili nei sistemi biologici (cioè metaboliti primari e secondari). Queste tecnologie possono essere utilizzate per far progredire la scoperta della chimica dei prodotti naturali per identificare potenziali nuovi farmaci candidati che aiuteranno a sostenere la salute e la lotta contro malattie e malattie. Nel caso di NMR di estratti grezzi, i modelli possono essere facilmente visualizzati e interpretati utilizzando l’analisi dei dati multivariati. Questo può essere effettuato in modo comparativo distinguendo le differenze tra estratti relativamente simili o può essere collegato a una specifica attività biologica (generalmente in vitro). In definitiva ciò consente la costruzione di un database complesso del metaboloma .

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