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El Papel Evolutivo de los Productos Naturales de las Selvas Tropicales como Fuente Reponible de Nuevos Fármacos

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Enfoques modernos en el descubrimiento de fármacos a partir de productos naturales

La llegada de nuevas tecnologías en espectrometría de masas, RMN y otras técnicas espectroscópicas, detección de blancos bimoleculares o basados en células, caracterización temprana de impactos y la utilización de métodos computacionales han mejorado el impacto de los productos naturales en el descubrimiento de fármacos basados en HTS. Los extractos de productos naturales a menudo contienen un gran número de componentes que comprenden aquellos, que son difíciles de separar. Las estructuras inequívocas de los compuestos puros se pueden determinar mediante la combinación de técnicas convencionales como la espectroscopia de absorción ultravioleta (UV), IR, MS y RMN. En casos raros, donde hay una dificultad para determinar la configuración absoluta, se emplea el análisis de rayos X de un solo cristal. Las técnicas de separación convencionales consumen mucho tiempo y son tediosas. La separación directa de una técnica de separación competente con técnicas espectroscópicas eficientes, como HPLC-FTIR, se puede utilizar para apoyar el proceso de desreplicación . HPLC-FTIR se ha utilizado para detectar grupos funcionales en los componentes principales de las mezclas, pero no ha encontrado una aplicación extensa debido a limitaciones en la compatibilidad, es decir, para obtener una separación óptima acompañada de una detección adecuada .

Una de las nuevas tecnologías en el descubrimiento de fármacos a partir de productos naturales es el uso de electroforesis capilar (CE) en el programa de detección desarrollado por primera vez por Cetek Corporation y Cubist. El ensayo es capaz de identificar compuestos/ extractos de productos naturales activos y detectar cualquier cambio en la proteína cuando un ligando se une a ella debido a los cambios de conformación y carga superficial. La técnica CE puede distinguir entre compuestos de unión débiles y fuertes en extractos antes de determinar su concentración . Esta tecnología se ha aplicado al programa interno de descubrimiento de fármacos de Cetek para encontrar nuevos compuestos de productos naturales que inhiben el objetivo del cáncer, HSP90, una chaperonina molecular que es responsable de mantener el plegado y la estabilidad correctos de las proteínas . Otro ejemplo interesante que fue reportado recientemente por Wang, et al.demostró que se ha aplicado con éxito un método CE junto con cromatografía líquida-espectrometría de masas en tándem (LC-MS/MS) en la selección de extractos de plantas, identificó con éxito un compuesto natural llamado baicalina de Radix scutellariae como un nuevo inhibidor de la proteína quinasa an . En otro estudio separado, Zhao y Chen desarrollaron un microrreactor capilar inmovilizado por neuraminidasa simple y eficaz, facbricado por tecnología de reticulación de glutaraldehído para la detección de inhibidores de la neuraminidasa de medicamentos tradicionales chinos. Seis de cada dieciocho productos naturales, incluidos bavachinin, bavachin, baicaleína, baicalina, crisina y vitexina, se han encontrado como inhibidores potentes de la detección. Algunos aspectos importantes de CE que merecen un reconocimiento en este capítulo son su facilidad de uso, versatilidad y componentes de separación de alta resolución, alta eficiencia de separación y su bajo consumo de muestras y reactivos.

Análisis de inyección de flujo-RMN (FIA-RMN) abarca una muestra, que se inyecta como un tapón en una corriente de fluido y luego se barrió en la bobina del detector de RMN. En una RMN FIA, la fase móvil se utiliza como solvente de empuje hidráulico que transfiere la muestra inyectada desde el puerto del inyector a la celda de flujo de RMN. El escáner scout que se utiliza para determinar la ubicación de los picos de disolvente es obtenido por el espectrómetro una vez que la bomba se detiene. Finalmente, se envía una señal a la bomba de disolvente para que se pueda eliminar la muestra antigua de la celda de flujo de RMN . HPLC-NMR-MS es un método espectrométrico novedoso y más avanzado que se utiliza en la des-replicación de extractos de productos naturales . A pesar de ser el método más efectivo, el beneficio de la metodología con guiones mencionada anteriormente es la coincidencia de los datos de la EM con el espectro de RMN. Además, la información de los grupos funcionales (p. ej., partes hidroxilo y amino) que son liberadas por la HPLC-la RMN se identifica fácilmente mediante técnicas de EM. La llegada de imanes de campo superior y criosondas había demostrado que la HPLC-RMN era un instrumento espectroscópico fuerte y eficaz y se aplicaba a los extractos crudos (RMN y perfil UV de la detección de HPLC PDA). Hay una mejora significativa en la sensibilidad de perfilado y la des-replicación de productos naturales debido a la utilización de imanes de campo más altos y los recientes desarrollos de la HPLC-RMN de micro bobina y la RMN capilar (CapNMR), que ha permitido examinar cantidades más pequeñas de muestras del orden de 40-120 µL . La HPLC-NMR de micro bobina es la más adecuada para HPLC-NMR en línea que utiliza los experimentos de flujo on, flujo stop o silenciamiento de tiempo para separar componentes presentes en mayores concentraciones y analizar los mismos , mientras que la RMN capilar utiliza disolventes no deuterados en una separación de HPLC fuera de línea, ofreciendo así una amplia gama de disolventes con un bajo costo. Los compuestos aislados se vuelven a disolver en disolventes deuterados y luego se inyectan en la sonda de flujo CapNMR utilizando volúmenes de alrededor de 6 µL con espectros de 1H-RMN adquiridos para cantidades de muestra del orden de 2-30 µg, aumentando así la sensibilidad con la perspectiva de clasificar los nuevos metabolitos secundarios de bajo nivel .

Además de lo anterior, la información obtenida de los espectros de RMN 1D y 2D es suficiente para clasificar los compuestos, además de proporcionar una instantánea de «alta fidelidad» de los constituyentes en el extracto, proporcionando así la información que allana el camino para decisiones racionales sobre el método superior de fraccionamiento o para continuar con el aislamiento. Se ha informado de muchas publicaciones recientes que utilizan este enfoque .La técnica y utilización de la HPLC-RMN en la identificación y clasificación de productos naturales está bien reconocida en la bibliografía, pero las aplicaciones de sus usos se han limitado principalmente a la elaboración de perfiles químicos de plantas . Numerosos modos de HPLC-RMN (principalmente en flujo y modos de flujo de parada) combinan el poder de resolución de la cromatografía, que está interconectada con la comprensión estructural proporcionada por la RMN. El enfoque reduccionista no ha tenido mucho éxito en el descubrimiento de medicamentos eficaces para tratar enfermedades complejas, como el cáncer, las enfermedades metabólicas, cardiovasculares y neurológicas. Los fármacos de un solo objetivo no siempre pueden inducir el efecto deseado a todo el sistema biológico, incluso si inhiben o activan con éxito un objetivo específico.Existen limitaciones en el uso del enfoque reduccionista o monobanco en el descubrimiento de fármacos. El enfoque solo produce una comprensión limitada de la patogénesis complicada y las patologías de múltiples objetivos de enfermedades sistémicas como el cáncer, las enfermedades cardiovasculares y los trastornos neurodegenerativos. Es difícil identificar las intervenciones pertinentes para abordar esas complejidades. La intervención farmacológica basada en balas o monobjetivo no puede combatir eficazmente las patologías complejas de las enfermedades sistémicas, ya que están reguladas por redes biológicas complejas y dependen de múltiples pasos de desafíos genéticos y ambientales para progresar. Recientemente, existe un creciente interés en utilizar enfoques innovadores para el descubrimiento de medicamentos a partir de productos naturales por parte de la farmacología en red, que integra la biología de sistemas y la farmacología . El concepto multidisciplinario integrado de múltiples dianas, múltiples efectos y enfermedades complejas en farmacología de red ha enriquecido nuestra comprensión de la patogénesis complicada y las patologías de múltiples dianas de las enfermedades sistémicas y ha reducido la dificultad para identificar intervenciones relevantes para abordar tales complejidades. Las tecnologías «icicas » en biología de sistemas se han utilizado ampliamente para correlacionar y dilucidar múltiples objetivos y redes de enfermedades humanas y acciones farmacológicas . El concepto de farmacología en red es especialmente útil para traducir e interpretar con precisión los efectos terapéuticos de las hierbas medicinales en significados bioquímicos y biológicos modernos. Los medicamentos a base de hierbas pueden servir como recursos valiosos para el descubrimiento de medicamentos de múltiples objetivos basados en redes. El concepto de farmacología en red es especialmente útil para traducir e interpretar con precisión los efectos terapéuticos de las hierbas medicinales en significados bioquímicos y biológicos modernos. La eficacia de los fármacos multi-objetivo a partir de extractos de hierbas se desarrolla seguida de la identificación de sus principales componentes bioactivos y el desarrollo de una formulación multicomponente completamente nueva compuesta por los principales componentes bioactivos para alcanzar una combinación sinérgica y óptima .

La combinación de enfoques de química de productos naturales y metabolómica en el descubrimiento de fármacos es una nueva estrategia para descubrir nuevos fármacos. Hay pocos informes en la literatura científica que discutan la unísono de los enfoques clásicos de la química de productos naturales con la metabolómica para identificar nuevos productos naturales bioactivos. Estos se han centrado generalmente en el estudio de las plantas . La identificación de productos naturales bioactivos a partir de plantas sigue siendo una tarea multifacética debido a su alta diversidad química y complejidad. Al medir el metaboloma de diferentes extractos o fracciones de una planta y combinar estos datos con su actividad biológica correspondiente, se pueden determinar potencialmente señales relacionadas con los compuestos relacionados con la actividad mostrada. La biología de sistemas es un campo muy prometedor que abarca herramientas en la revolución postgenómica, como la transcripción omica, la proteómica, la glucómica y la fluxómica, con la intención de caracterizar todos los productos genéticos y celulares que incluyen completamente el ARNm, las proteínas, las estructuras de glicanos y los metabolitos. La metabolómica tiene como objetivo construir observaciones equilibradas utilizando herramientas altamente reproducibles, seguidas por el análisis de datos para localizar las correlaciones entre los datos disponibles. El perfil de todos los metabolitos de bajo peso molecular de un organismo no es posible y, por lo tanto, este campo emergente de la metabolómica combina química analítica, bioquímica y biología computacional, lo que permite el análisis de miles de metabolitos en cualquier sistema biológico. Las principales plataformas analíticas son la espectrometría de masas con cromatografía de gases (MS-GC), cromatografía de líquidos (LC) o electroforesis capilar (CE) y espectroscopia de RMN. Un procedimiento de extracción equilibrado para extraer de manera eficiente todos los metabolitos primarios y secundarios de los tejidos y los fluidos corporales se utiliza para obtenerlos en forma natural antes del análisis en los diversos disolventes utilizados. Los procedimientos de extracción de metabolitos son más complicados y complejos debido a la naturaleza diversificada de las moléculas pequeñas presentes y debido a la falta de una sola técnica analítica y plataforma que ayude en el análisis de todos los metabolitos simultáneamente. Es necesario aplicar varias técnicas y metodologías de separación para lograr un análisis completo de los metabolitos . El análisis simultáneo de cientos de compuestos se logra mediante diversas herramientas informáticas que extraen información de los datos, eliminan el ruido de fondo, detectan e integran picos en grandes conjuntos de datos y normalizan y transforman las matrices de datos resultantes antes de cualquier análisis estadístico . La metabolómica tiene un acceso restringido a la capacidad de identificar las señales con respecto a la naturaleza química. Alrededor del 60 al 80% de todos los compuestos detectados son desconocidos incluso hoy en día y la disciplina metabólica ha creado una gran masa de biblioteca de RMN espectral para abordar este problema. Estas estructuras de metabolitos secundarios desconocidos pueden ser uno de los recursos desconocidos de los productos naturales, huellas dactilares, huellas dactilares, perfiles o análisis de blancos son términos comunes utilizados en este campo. La toma de huellas dactilares tiene como objetivo tomar una «instantánea» del organismo en la que las señales no pueden utilizarse necesariamente para detectar/identificar metabolitos específicos y dependen en gran medida de la técnica utilizada. Las señales se asignan a un metabolito, independientemente de que su naturaleza sea un compuesto conocido o nuevo. El término análisis de objetivos tiene como objetivo determinar y cuantificar un metabolito específico de interés .

El microarray es una nueva tecnología desarrollada recientemente que ha empoderado a la comunidad científica para comprender los aspectos fundamentales que subyacen al crecimiento y desarrollo de la vida, así como para explorar las causas genéticas de las anomalías que ocurren en el funcionamiento del cuerpo humano.La tecnología de microarrays de ADN puede analizar y comparar cambios en el ADN o las proteínas. Un cambio cromosómico en un individuo anormal podría identificarse cuando el ADN de este individuo se compara con el ADN (control) de un individuo sano. Es muy preciso y útil, ya que es capaz de detectar cambios mucho más pequeños en comparación con la técnica de cariotipado convencional. Esta técnica competente nos permitió comprender los aspectos elementales que subyacen al crecimiento y desarrollo de la vida, así como explorar las causas genéticas de las anomalías que ocurren en el funcionamiento del cuerpo humano. La tecnología de microarrays se ha utilizado ampliamente en farmacogenómica, donde el análisis comparativo de los genes de una célula normal y no saludable ayudará a identificar la constitución bioquímica de las proteínas sintetizadas por los genes anormales/no saludables. La información obtenida del análisis podría utilizarse para la síntesis y el diseño de fármacos que combatan las proteínas anormales y reduzcan su efecto .Kwon y sus colegas han desarrollado un enfoque in vitro utilizando un sistema de microarrays que contiene múltiples enzimas para la síntesis de alto rendimiento de productos derivados de polipéptidos y su posterior cribado completo de la tirosina quinasa humana (TK) basado en una biblioteca basada en polietidos, en un solo microarrays de vidrio. Se espera que los inhibidores de los ct traten la leucemia mieloide crónica, los tumores del estroma gastrointestinal y el cáncer de mama .

Un programa de descubrimiento de medicamentos tiene como objetivo encontrar nuevos productos naturales bioactivos, que posean alguna forma de actividad biológica potente. Sin embargo, el aislamiento de productos naturales conocidos e indeseables sin interés farmacológico o químico es inevitable. El término desreplicación, que es un proceso de identificación de compuestos conocidos responsables de la actividad de un extracto antes del aislamiento guiado por bioensayos, se vuelve popular entre los investigadores de productos naturales . Las estrategias de desreplicación generalmente implican una combinación de bioensayos, ciencia de separación, métodos espectroscópicos y búsqueda en bases de datos, y pueden considerarse procesos de cribado químico o biológico. Hay varias formas en que los programas de productos naturales abordan la desreplicación, que se basa en la disponibilidad de métodos/instrumentación de detección, el tiempo y el costo para identificar posibles «pistas biológicas o compuestos nuevos» a partir de un extracto crudo. En la actualidad, existen muchas metodologías y protocolos avanzados que distinguen entidades novedosas de compuestos naturales conocidos en una etapa temprana de un programa de descubrimiento de medicamentos o en una estrategia de aislamiento de productos naturales . El proceso de desreplicación se puede realizar fácilmente mediante la selección de los compuestos a través de las bases de datos disponibles comercialmente, lo que reduce el tiempo necesario para la elucidación de la estructura de los compuestos conocidos. Un ejemplo es el Diccionario de Productos Naturales de Chapman y Hall; El Diccionario de Productos Naturales Marinos (en línea) (subconjunto del Diccionario de Productos Naturales) que contiene más de 30.000 compuestos; MarinLit-La Base de Datos de Productos Naturales Marinos que contiene datos bibliográficos actualizados sobre organismos marinos con el número de referencias de 1.200 revistas / libros y datos de aproximadamente 21.000 compuestos ; La antimarina es una base de datos más reciente, en la que se puede buscar el número de grupos metilo, el número de protones de metileno o metina hibridados con sp3, grupos alqueno, acetal, éter y formilo . Además, SciFinder Scholar y SCOPUS son importantes herramientas de descubrimiento de investigación (Resúmenes químicos en línea) y NAPRALERTTM es una base de datos de todos los productos naturales, incluida información etnomédica, farmacológica/bioquímica de extractos de organismos in vitro, in situ, in vivo, en humanos (informes de casos, ensayos no clínicos) y estudios clínicos . La disponibilidad de estas bases de datos científicas, como las mencionadas a las instituciones académicas y de investigación, es un paso fundamental y crucial en un programa de productos naturales bien gobernado. Con el aumento del número de nuevos objetivos de fármacos, se han aplicado métodos computacionales como el cribado virtual de alto rendimiento, herramientas de acoplamiento de ligandos, perfiles ADME (absorción, distribución, metabolismo y excreción) y otras herramientas y programas informáticos modernos para acelerar el proceso de descubrimiento de fármacos. Algunas de las bibliotecas y bases de datos de productos naturales comunes que se enumeran a continuación permiten la detección rápida de una gran cantidad de compuestos naturales en un corto período de tiempo contra una variedad de objetivos de medicamentos. Diccionario De Productos Naturales (http://dnp.chemnetbase.com/intro/index.jsp); Base De Datos De Productos Naturales Marinos De UCSD (http://naturalprod.ucsd.edu/); Alerta De Productos Naturales (http://napralert.org/); ZINC (http://zinc.docking.org/browse/catalogs/natural-products); InterBioScreen (http://www.ibscreen.com/products.shtml); AnalytiCon Discovery (http://www.ac-discovery.com/); Molecular Diversity Preservation International (http://www.mdpi.org/). Los modelos generados por computadora de proteínas que incluyen enzimas y receptores nuevos, aparte de las estructuras cristalinas de proteínas que se depositan en el Banco de Datos de Proteínas (http://www.pdb.org/), se pueden generar fácilmente mediante el modelado de homología seguido posteriormente por un acoplamiento molecular simple para examinar las interacciones entre los compuestos naturales y las proteínas diana. Los bioensayos se pueden llevar a cabo selectivamente en los golpes naturales o cables recuperados sin la necesidad de desperdiciar la valiosa cantidad de compuestos y evitar métodos experimentales costosos y que consumen mucho tiempo. Ejemplos de softwares de acoplamiento molecular disponibles actualmente son AutoDock, AutoDockVina, FlexX, FRED, GOLD, eHiTS y buscadores de plomo. Algunos ejemplos que utilizan el cribado virtual de alto rendimiento, incluido el trabajo de Wang et al. donde diez compuestos naturales han sido identificados con éxito como inhibidores de flacipain-2 (FP-2) y Liu et al. la OMS ha identificado un producto natural, como un inhibidor de la dimerización STAT3, mediante un cribado virtual basado en la estructura .

También se ha informado de que otras herramientas bioinformáticas, como la detección de ligandos y farmacóforos basados en estructuras, ayudan con éxito en el proceso de descubrimiento de medicamentos a partir de productos naturales. Chen et al. han propuesto un modelo farmacóforo cuantitativo tridimensional de relación estructura-actividad basado en inhibidores conocidos de mTOR. El cribado virtual utilizando el mejor modelo de farmacóforo recuperó con éxito 20 productos naturales como posibles andamios de inhibidores de mTOR. También es importante mencionar aquí que del estudio anterior de Doman mostró que de las 365 moléculas sugeridas por el acoplamiento, 127 (34,8%) de ellas inhibieron la actividad de la proteína enzimática tirosina fosfatasa-1B (PTP1B), mientras que solo 85 (0,021%) de aproximadamente 400.000 moléculas se recuperaron de un ensayo experimental de alto rendimiento. Eso es alrededor de 1700 veces el enriquecimiento de la tasa de aciertos del acoplamiento basado en la estructura sobre el cribado aleatorio .Por otro lado, la incorporación de herramientas quimioinformáticas en el descubrimiento de medicamentos a partir de productos naturales permite que los compuestos se examinen para determinar sus propiedades ADMET (absorción, distribución, metabolismo, excreción y toxicidad) antes de que se inscriban en cualquier programa de desarrollo de medicamentos. El cribado de compuestos naturales utilizando la «Regla de 5» de Pfizer permite a los investigadores eliminar cualquier molécula que no obedezca las reglas. Dado que estas reglas se derivaron de un conjunto de observaciones experimentales de miles de medicamentos conocidos y moléculas similares a los medicamentos, un químico/bioquímico medicinal capacitado puede usar fácilmente los in silicodata como guía para determinar los compuestos naturales potenciales similares a los medicamentos seguidos de la síntesis de análogos adicionales para que tengan propiedades similares a los medicamentos favorables. Una buena molécula similar al fármaco en general obedece las siguientes reglas (i) peso molecular ≤ 500, (ii) LogP calculado ≤ 5, (iii) número de donantes de enlaces de hidrógeno ≤ 5, y (iv) número de aceptadores de enlaces de hidrógeno ≤ 10. La introducción de instalaciones de cribado de silicona y productos naturales para cribado de alto rendimiento en laboratorios académicos y en compañías farmacéuticas reduce el costo del cribado aleatorio de colecciones muy grandes de compuestos. En silicoor, el cribado virtual ayuda a filtrar el número de compuestos utilizados en las cribas reales . Por otro lado, una herramienta bioinformática como el Diccionario de Productos Naturales proporciona información estructural sobre 150.000 compuestos diferentes que podrían utilizarse en el cribado virtual, a pesar de que los compuestos todavía tendrían que estar físicamente disponibles para que cualquier actividad prevista se confirmara mediante pruebas en un ensayo relevante. Finalmente, la agrupación de andamios químicamente relacionados puede ser muy útil para guiar la síntesis de nuevos compuestos, pero obviamente hay un retraso y un gasto en la síntesis.

Una colaboración académica ha establecido el Portal de Descubrimiento de Fármacos (véase http:// www.ddp.strath.ac.uk/) en un intento de combinar las técnicas de cribado virtual de productos naturales químicamente diversos y sus análogos sintéticos con la rápida disponibilidad de muestras físicas para pruebas, esto permite una amplia variedad de compuestos de laboratorios académicos en muchas instituciones diferentes en una base de datos que se puede utilizar para el cribado virtual. Los grupos de biología académica también proponen estructuras proteicas nuevas y novedosas como objetivos para el cribado virtual con la base de datos del Portal (y con las bases de datos convencionales disponibles comercialmente). Cuando se pronostican impactos a partir de la filtración de silicio, los compuestos se pueden obtener del químico de origen para pruebas confirmatorias. A menudo, hay un vínculo inmediato con la experiencia para la preparación de análogos para ayudar a iniciar un programa de optimización de clientes potenciales. No obstante, el acceso al Portal es gratuito para el grupo académico. La continua expansión de la base de datos de productos químicos significa que hay una valiosa y creciente cobertura del espacio químico de muchos compuestos químicos novedosos. Aunque los compuestos en la base de datos del Portal generalmente ya se han divulgado en una tesis o en una revista de química, muy pocos de ellos han sido probados previamente para detectar actividad biológica. Esta es una característica común de los productos naturales conocidos: de las 150.000 estructuras en el Diccionario CRC de Productos Naturales, solo el 1% de ellas han sido investigadas. La introducción de tecnologías de metabolómica en los procesos de descubrimiento de productos naturales será beneficiosa en múltiples niveles. Al aumentar el número de identificaciones en nuestros datos de metabolómica, se pueden obtener y probar fácilmente compuestos con estructuras nuevas para detectar cualquier enfermedad bajo investigación. Además, el análisis de múltiples paralelos utilizando tecnologías de metabolómica también mejorará el rendimiento de los procesos de caracterización química de muchas especies diferentes de los recursos naturales. Dado que los químicos de productos naturales han recopilado toda una vida de bibliotecas de compuestos de compuestos puros activos e inactivos, estos datos se pueden utilizar para construir las bibliotecas espectrales de masas y de RMN, sin duda ayudan a que las interpretaciones biológicas de los datos metabolómicos se hagan con menos dificultad. Los avances en la instrumentación analítica y la sofisticada división de las técnicas de separación con detectores de alta sensibilidad han permitido una mayor detección de compuestos de moléculas pequeñas mensurables en sistemas biológicos (es decir, metabolitos primarios y secundarios). Estas tecnologías se pueden utilizar para avanzar en el descubrimiento de la química de productos naturales para identificar posibles candidatos a nuevos medicamentos que ayudarán a mantener la salud y a luchar contra las enfermedades. En el caso de la RMN de extractos crudos, los patrones se pueden visualizar e interpretar fácilmente utilizando el análisis de datos multivariantes. Esto puede llevarse a cabo de manera comparativa, distinguiendo diferencias entre extractos relativamente similares o puede vincularse con una actividad biológica específica (generalmente in vitro). En última instancia, esto permite la construcción de una base de datos compleja del metaboloma .

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